여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
호중구에 의한 세포외 트랩(ETs)의 방출은 만성 염증과 관련된 질병의 발병에 기여하는 요인으로 확인되었습니다. 호중구 ETs (NETs)는 DNA, 히스톤 단백질 및 다양한 과립 단백질 (즉, 골수 페록시다제, 엘라스타아제 및 카테신 G)의 메쉬로 구성됩니다. 대 식 세포를 포함 하 여 다른 면역 세포, 또한 ETs를 생산할 수 있습니다.; 그러나, 이것이 생체 내에서 어느 정도 발생하고 대식세포 외 트랩(METs)이 병리학적 메커니즘에서 역할을 하는지 여부는 구체적으로 조사되지 않았다. 염증성 병리학에서 MET의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 면역 형광 실험에서 악용될 수 있는 시험관 내 1차 인간 대식세포로부터 MET 방출을 시각화하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 이것은 이 구조물의 추가 특성화 및 호중구에서 풀어 놓인 ETs에 그들의 비교를 허용합니다. 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDM)는 M1 프로-염증 표현형에 대한 분화 후 상이한 염증 자극에 노출시 MET를 생성한다. MET의 방출은 살아있는 세포 (예를 들어, SYTOX 녹색)에 불침투되는 녹색 형광 핵산 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 가시화 될 수 있습니다. HMDM과 같은 갓 분리된 1차 대식세포의 사용은 잠재적인 임상 적용과 관련된 생체 내 염증 성 이벤트를 모델링하는 데 유리합니다. 이 프로토콜은 또한 인간 단핵구 세포주(예를 들어, THP-1)로부터의 MET 방출을 연구하기 위해 포르볼 마이리스테이트 아세테이트 또는 다른 대식세포 세포주(예를 들어, 뮤린 대식세포-유사 J774A.1 세포)를 이용한 대식세포로의 분화에 사용될 수 있다.
서론
호중구에서 ETs의 방출은 세균성 감염에 의해 시작되는 선천적인 면역 반응으로 처음 확인되었습니다1. 그(것)들은 항균 특성을 가진 각종 과립 단백질이 호중구 엘라스타아제 및 골수페록시다아제2를포함하여 결합되는 DNA 백본으로 이루어져 있습니다. 호중구 ETs (NETs)의 주요 역할은 병원체를 포착하고 그들의 제거를 촉진하는것입니다 3. 그러나, 면역 방어에 있는 ETs의 보호 역할 이외에, 연구 결과의 증가는 또한 질병 병인에 있는 역할을, 특히 염증 구동한 질병의 발달 도중 발견했습니다 (즉, 류마치스성 관절염 및 죽상 동맥 경화증4). ETs의 방출은 인터류킨 8 (IL-8) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)5,6,및 국부적 인 축적을 포함한 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발될 수 있으며, ET의 국소축적은 조직 손상을 증가시키고 불러일으키고 프로 염증 반응7. 예를 들어, ETs는 동맥경화증8의발달에 인과적 역할을 하는....
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프로토콜
HMDM은 시드니 지역 보건 지구의 윤리 승인을 받아 혈액 은행이 제공하는 인간 버피 코트 제제에서 분리되었습니다.
1. HMDM 문화
- 림프구를 분리하기 위해 시판되는 제제를 사용하여 건강한 인간 기증자의 말초 혈액으로부터 제조된 버피 코트 제제로부터 단핵구를 분리하고, 이어서 역전류 원심용해19, 20.
- 단핵구 특성화에 대한 변형 된 Giemsa 얼룩으로 세포 방사 및 염색에 의한 단핵구의 존재를확인19.
- 멸균 조건에서 혈청 없이 RPMI-1640 매질로 단핵구밀도를 1 x 106 셀/mL로 조정합니다. 이 세포 현탁액의 1 mL를 12웰 조직 배양 판의 각각의 웰에 첨가한다. 37°C에서 세포 인큐베이터에서 배양하여 5%CO2의 존재에 대해 2시간 동안 조직 배양판에 대한 순응을 촉진한다.
- 멸균 조건하에서, 세포 매체를 제거하고 10% (v/v) 풀링된 인간 혈청 및 20 mM L-글루타민을 포함하는 완전한 RPMI-1640 배양 매체로 대체한다.
- 세포 인큐베이터에....
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결과
세포 분화에 대한 자극에 반응하여 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 브라이트필드 이미지는 도 1에나타내고 있다. IFNγ 및 LPS에 노출된 HMDM을 사용하여 실험에서 M1 편광 대식세포는 도 1(중간 패널)의 검은 화살표에 의해 나타난 바와 같이 길쭉하고 스핀들 같은 세포 형상을 보였다. 비교를 위해, 48h에 대한 HMDM에 HMDM을 노출한 후 M2 편광 대식세포의 형태는 도 1(맨 오른쪽 패널)의 검은 화살표에 의해 지시된 바와 같이 전형적으로 둥글고 평평하였다.
MET를 방출하는 분화된 HMDM 표현형의 능력은 그림 2에제시된 바와 같이 SYTOX 녹색을 가진 살아있는 세포 형광 화상 진찰에 의해 구상되었다. 도 2A는.......
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토론
M1 분화된 HMDMs를 이용한 MET 형성의 생성 및 시각화는 이러한 대식세포 구조의 잠재적인 병리학적 역할을 조사하는 데 유용할 수 있는 새로운 시험관 내 모델을 나타내며, 특히 만성 염증성 하에서 조건. 그것은 또한 인간 단핵구 또는 뮤린 대식세포 세포주를 가진 관련 연구 결과에서 이용될 수 있는 MET를 풀어 주기 위하여 1 차적인 인간 대식세포의 자극을 위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. HMDM에 의한 MET 형성의 자극을 위한 이 프로토콜의 성공적인 구현은 양호한 세포 생존력을 유지하기 위해 신중한 세포 배양 및 취급에 의존한다. 이렇게 하면 관찰되는 MET의 범위와 품질이 향상됩니다. 더 나은 세포 영양을 제공하기 위해, HMDM을 유지하는 데 사용되는 RPMI 매체는 태아 소 혈청뿐만 아니라 L-글루타민을 포함하는 인간 혈청을 포함해야합니다. 이 완전한 RPMI 미디어의 각 재고 솔루션은 1주일 이내에 사용해야 합니다. 미디어의 올바른 저장도 중요합니다. 매체는 빛이 없는 경우 4°C에서 보관해야 한다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 영구 충격 보조금 (IPAP201601422)과 노보 노디스크 재단 생물 의학 프로젝트 보조금 (NNF17OC0028990)에 의해 지원되었다. YZ는 또한 시드니 대학에서 호주 대학원 상을 수상한 것을 인정합니다. 우리는 단핵구 격리 및 조직 문화에 도움을 주셔서 씨 팻 피산사라킷과 모건 존스 씨에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 120Q 광역 스펙트럼 형광 광원 | EXFO Photonic Solutions, 토론토, 캐나다 | x-cite 시리즈 | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | 세포 배양용 |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | 단핵구의 특성화 |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | 세척 단계 및 HOCl 처리용 |
| 차아염소산(HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | MET 자극용 |
| 인터페론 감마 | Thermo-Fisher | PMC4031 | M1 프라이밍용 |
| 인터루킨 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | M2 프라이밍용 |
| 인터루킨 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | MET 자극용 |
| L-글루타민 | Sigma-Aldrich | 59202C | 배양 배지에 추가 |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | M1 프라이밍용 |
| 림프hoprep | Axis-Shield PoC | AS 1114544 | 단핵구 분리용 |
| Olympus IX71 반전 현미경 | 올림푸스, 도쿄, 일본 | ||
| Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA) | 시그마-알드리치 | P8139 | MET 자극 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | 시그마-알드리치 | D5652 | 세척 단계 |
| RPMI-1640 매체 | 시그마-알드리치 | R8758 | 세포 배양 |
| SYTOX 그린 | 라이프 테크놀로지 | S7020 | MET의 경우 visulaization |
| TH4-200 명시야 광원 | 올림푸스, 도쿄, 일본 | x-cite 시리즈 | |
| 종양 괴사 인자 알파 | Lonza | 300-01A-50 | MET 자극 |
참고문헌
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
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재인쇄 및 허가
