분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

호중구에서 ETs의 방출은 세균성 감염에 의해 시작되는 선천적인 면역 반응으로 처음 확인되었습니다^1. 그(것)들은 항균 특성을 가진 각종 과립 단백질이 호중구 엘라스타아제 및 골수페록시다아제^2를포함하여 결합되는 DNA 백본으로 이루어져 있습니다. 호중구 ETs (NETs)의 주요 역할은 병원체를 포착하고 그들의 제거를 촉진하는^{것입니다 3.} 그러나, 면역 방어에 있는 ETs의 보호 역할 이외에, 연구 결과의 증가는 또한 질병 병인에 있는 역할을, 특히 염증 구동한 질병의 발달 도중 발견했습니다 (즉, 류마치스성 관절염 및 죽상 동맥 경화증^4). ETs의 방출은 인터류킨 8 (IL-8) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)^5,6,및 국부적 인 축적을 포함한 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발될 수 있으며, ET의 국소축적은 조직 손상을 증가시키고 불러일으키고 프로 염증 반응⁷. 예를 들어, ETs는 동맥경화증^8의발달에 인과적 역할을 하는 것으로, 혈전증^9를촉진하고, 심혈관^{위험도 10을}예측하는 것으로 연루되어 왔다.

이제 호중구 이외에, 다른 면역 세포(즉, 비만 세포, 호산구, 및 대식세포)가 미생물 또는 프로-염증 자극에 노출될 때 ET를 방출할 수 있다는 것을 인식하고^{있다 11,12.} 이것은 만성 염증성 질병의 발달, 규칙 및 해결에 있는 그들의 중요한 역할을 고려하여 대식세포의 경우에 특히 중요할 지도 모릅니다. 따라서 대식세포에서 ET 방출과 염증 관련 질병 개발 사이의 잠재적 인 관계를 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 최근 연구는 그대로 인간의 죽상 경화성 플라크와 조직 혈전^13에METs와 NETs의 존재를 보여 주었다. 유사하게, MET는 선동적인 반응의 규정을 통해 신장 상해를 운전에 연루되었습니다^14. 그러나, 호중구와는 달리, 대식세포로부터의 MET 형성 메커니즘에 대한 제한된 데이터가 있다. MET 형성의 인간 체외 모델을 이용한 최근 연구는 각 세포 유형에 관여하는 경로에 약간의 차이를 보여준다 (즉, 대식세포와 히스톤 시트룰린의 부재에 관한)^6. 그러나, 일부는 NET 방출이 히스톤 시트룰린^(15)의부재에서 발생할 수 있음을 보여 주었다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상적으로 관련된 대식세포 모델에서 MET 방출을 평가하는 간단하고 직접적인 방법을 제공하는 것입니다. METs(즉, THP-1 인간 단핵구 세포주 및 다양한 뮤린 대식세포 세포주)를 연구하기 위해 사용되어 온 여러 가지 시험관내 대식세포 세포 모델이^{있다 16.} 이러한 모델과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시키는 것은 일반적으로 단백질 키나아제 C(PKC) 의존적 경로를 활성화시키는 포르볼 마이스테이트 아세테이트(PMA)의 첨가와 같은 프라이밍 단계를 필요로 한다. 이 과정은 ET 방출^4를 트리거하는 것으로 알려져 있으며 THP-1 세포로부터 낮은 기저 MET 방출을 초래한다. 다른 연구는 PMA 처리 된 THP-1^세포17에비해 생체 내에서 대식세포에 의해 장착 된 생체 활성 및 염증 반응의 몇 가지 차이점을 강조했다.

유사하게, 상이한 뮤린 대식세포유사 세포주들의 거동및 염증반응은 1차 인간 대식세포의 반응 스펙트럼을 완전히 나타내지^{않는다(18).} 따라서, 임상 적 설정에서 대식세포 ET 형성을 조사하기 위한 목적으로, 1차 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDMs)는 단낭 또는 무린 대식세포 유사 세포주보다는 보다 관련성이 있는 모델로 여겨진다.

M1 편광 HMDMs로부터의 ET 방출은 골수페록시다아제 유래 산화하이포염소산(HOCl), PMA, TNFα 및 IL-8^6을포함하는 다수의 상이한 염증 자극에 이들 세포를 노출시킨 후 입증되었다. 여기서 설명된 프로토콜은 HMDM을 M1 표현형으로 편광시키고 이러한 염증 자극에 노출될 때 후속 MET 방출을 시각화하는 프로토콜이다. PMA는 호중구를 사용한 이전 연구와의 비교를 용이하게 하기 위해 MET 방출의 자극으로 사용됩니다. 중요하게도, HOCl, IL-8, 및 TNFα는 또한 생체 내에서 염증 환경의 더 나은 모델로 여겨지는 MET 방출을 자극하는데 사용된다. ET 방출의 가시화를 위한 현미경 방법은 SYTOX 녹색을 사용하여 살아있는 세포 배양에 있는 세포외 DNA를 염색하는 관련시킵니다, 이전 호중구 연구 결과에서 성공적으로 적용된 불투과성 형광 녹색 핵산 얼룩. 이 방법은 ET 방출의 신속하고 질적 평가를 허용하지만 ET 방출 범위의 정량화를 위한 독립형 방법으로는 적절하지 않다. 다른 처리 조건 또는 내정간섭에서 유래한 ET 방출의 넓이비교하기 위하여 정량화가 요구되는 경우에 대체 방법론을 이용되어야 합니다.

HMDM은 시드니 지역 보건 지구의 윤리 승인을 받아 혈액 은행이 제공하는 인간 버피 코트 제제에서 분리되었습니다.

1. HMDM 문화

1. 림프구를 분리하기 위해 시판되는 제제를 사용하여 건강한 인간 기증자의 말초 혈액으로부터 제조된 버피 코트 제제로부터 단핵구를 분리하고, 이어서 역전류 원심^{용해19, 20}.
2. 단핵구 특성화에 대한 변형 된 Giemsa 얼룩으로 세포 방사 및 염색에 의한 단핵구의 존재를^확인19.
3. 멸균 조건에서 혈청 없이 RPMI-1640 매질로 단핵구밀도를 1 x 10⁶ 셀/mL로 조정합니다. 이 세포 현탁액의 1 mL를 12웰 조직 배양 판의 각각의 웰에 첨가한다. 37°C에서 세포 인큐베이터에서 배양하여 5%_CO2의 존재에 대해 2시간 동안 조직 배양판에 대한 순응을 촉진한다.
4. 멸균 조건하에서, 세포 매체를 제거하고 10% (v/v) 풀링된 인간 혈청 및 20 mM L-글루타민을 포함하는 완전한 RPMI-1640 배양 매체로 대체한다.
5. 세포 인큐베이터에서 5%_CO2의 존재 하고 37°C에서 세포를 8일 동안 배양하고, 2일마다 배지를 변경한다.

2. HMDM의 양극화

1. 멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배양 배지에 인터페론 γ(IFNγ; 20 ng/mL) 및 리포폴리사카라이드(LPS; 1 μg/mL)를 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 제조한다. 완전한 RPMI-1640 배양 배지에 인터류키틴 4(IL-4; 20 ng/mL)를 추가하여 M2 프라이밍 미디어를 준비한다.
2. 멸균 조건 하에서, HMDM을 함유하는 조직 배양 플레이트 웰로부터의 배지는 섹션 1에 기재된 바와 같이 시드 및 배양되었다.
3. 멸균 PBS(37°C로 미리 데운 것)로 세포를 함유하는 웰을 1 mL 의 PBS 를 사용하여 조심스럽게 세척합니다.
4. HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 미디어의 1mL를 추가합니다(실험에 적합한 중 하나).
5. 세포 인큐베이터에서 5%_CO2의 존재에서 37°C에서 48시간 동안 세포를 배양한다.

3. MET 방출을 유도하는 HMDM의 자극

1. 멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배지에 MET 방출의 상이한 자극기(실험에 적합한 것)를 포함하는 배양 배지를 준비한다: PMA (25 nM), 인간 재조합 TNFα (25 ng/mL), 또는 인간 재조합 IL-8(50 ng/mL) ).
2. HOCl 자극을 가진 실험을 위해, 세포에 첨가하기 직전에 HBSS(37°C로 미리 데운 것)에서 HOCl(200 μM)을 준비한다. HOCl이 완전한 셀 매체에 준비되지 않았는지 확인합니다.
   참고: HOCl의 스톡 용액의 농도는 용액의 UV 흡광도를 292 nm 및 pH=11^6에서 측정하고 350^M-1cm-121의소멸 계수를 사용하여 정량화된다.
3. 섹션 2에 기재된 편광 처리 후, 각 웰로부터 세포 매체를 흡인하고 1 mL aliquots로 세포를 조심스럽게 세척합니다: 멸균 PBS(PMA, TNFα 및 IL-8용) 또는 HBSS(HOCl용)는 37°C로 미리 예열되었습니다.
4. PMA, TNFα 또는 IL-8을 실험하는 경우: 최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNFα 또는 IL-8을 포함하는 전체 매체의 1 mL을 첨가한다.
5. TNFα를 사용하여 실험하기 위해, 세포 인큐베이터에서 5%_CO2가 존재하면서 37°C에서 6시간 동안 세포를 배양한다. PMA 및 IL-8을 사용하여 실험하기 위해, 세포 인큐베이터에서 5%_CO2가 존재하면서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다.
6. HOCl을 가진 실험은, 마지막 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후에 HBSS에 HOCl의 1 mL를 추가합니다. 이어서, 세포 인큐베이터에서 5%_CO2의 존재 에서 37°C에서 15분 동안 세포를 배양한다.
   1. 조심스럽게 세포 상류를 흡인하고 단계 3.3에 기재된 바와 같이 HBSS의 1 mL aliquots로 세포를 3x 세척한다.
   2. 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후, 완전한 RPMI-1640 배양 배지의 1 mL을 추가합니다. 이어서, 세포 인큐베이터에서 5%_CO2의 존재 에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다.

4. 살아있는 세포 배양에서 MET의 시각화

1. 40 μM의 농도로 HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 준비합니다.
2. MET 방출을 유도하기 위해 섹션 3에 기재된 처리의 끝에서, HMDM을 함유하는 각 웰에 염료의 25 μL을 직접 첨가한다.
3. 실온(RT)에서 5분 동안 암흑에서 세포를 배양한다.
4. HMDM을 이미징용 반전형광현미경의 현미경 단계에 조직 배양 우물에 놓습니다.
5. 현미경 절차
   1. 고해상도 컬러 디지털 카메라로 설치된 광스펙트럼 형광광원, 브라이트필드 광원 및 반전현미경을 켭니다(재료 표참조).
   2. 필터 휠을 녹색 형광에 대한 "넘버 2" 위치(여기 = 504 nm, 방출 = 523 nm)로 회전하여 조직 배양 웰 내에 함유된 녹색 스테인드 샘플의 이미징을 위해.
   3. 5x 목표를 사용하여 거친 초점으로 이미지를 초점을 맞춘 다음 현미경 접안 렌즈를 통해 볼 때 이미지가 선명하고 선명하고 초점이 맞춰지도록 현미경의 미세 초점 노브를 표시합니다.
   4. 현미경을 카메라 모드로 전환합니다.
   5. 연결된 소프트웨어를 시작합니다.
   6. 소프트웨어에서 캡처 탭을 선택합니다.
   7. 재생 버튼을 클릭하여 이미지를 미리 보고 이미지가 소프트웨어 미리 보기 창에 선명하고 선명하고 초점이 맞물때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다.
   8. 캡처 버튼을 클릭합니다.
      참고: 캡처된 이미지가 함께 제공되는 소프트웨어에 자동으로 표시됩니다.
   9. 소프트웨어 내에서 파일 | 필요한 이미지 파일 유형으로 저장합니다.
   10. 현미경에서 필터 휠을 "숫자 5" 위치로 회전하여 밝은 시야 이미징을 하고 4.5.2-4.5.9 단계를 반복하여 해당 브라이트필드 이미지를 얻습니다.
   11. 후속 이미지 수집에 필요한 경우 4.5.2-4.5.10 단계를 반복합니다.

세포 분화에 대한 자극에 반응하여 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 브라이트필드 이미지는 도 1에나타내고 있다. IFNγ 및 LPS에 노출된 HMDM을 사용하여 실험에서 M1 편광 대식세포는 도 1(중간 패널)의 검은 화살표에 의해 나타난 바와 같이 길쭉하고 스핀들 같은 세포 형상을 보였다. 비교를 위해, 48h에 대한 HMDM에 HMDM을 노출한 후 M2 편광 대식세포의 형태는 도 1(맨 오른쪽 패널)의 검은 화살표에 의해 지시된 바와 같이 전형적으로 둥글고 평평하였다.

MET를 방출하는 분화된 HMDM 표현형의 능력은 그림 2에제시된 바와 같이 SYTOX 녹색을 가진 살아있는 세포 형광 화상 진찰에 의해 구상되었다. 도 2A는 임의의 염증 자극이 없는 상태에서 24시간 동안 배양된 각 HMDM 표현형으로부터 수득된 대조군 데이터를 나타낸다. 이 경우, 예상대로 매우 제한된 녹색 얼룩이 있었다, 이 얼룩의 세포 불변 특성을 감안할 때. 도 2B는 HOCl, PMA, IL-8 또는 TNFα에 M1 HMDM의 노출로 인한 MET에 대한 양성 염색을 나타냈다. MET는 세포 외 DNA의 가닥에서 유래하는 녹색 줄무늬로 표시된 흰색 화살표로 표시됩니다. HOCl으로, 세포 외 DNA를 염색 이외에, 세포에 명백한 몇몇 녹색 얼룩이 있었습니다. 이러한 세포 염색은 또한 다른 자극과 어느 정도 관찰되었고 치료 조건의 결과로 ET 독립적 세포 사멸로 인한 막 무결성의 손실을 반영하는 것으로 여겨진다.

도 2B는 또한 IL-4에 노출된 M2 HMDM으로 수행된 상응하는 실험을 나타낸다. 이 경우 세포 외 DNA의 가닥 / 줄무늬가 없는 것으로 나타난 세포에서 DNA가 방출되지 않았습니다. 하지만, HOCl 및 TNFα와 녹색 형광 염료의 일부 세포 섭취가 있었다. 비교 목적을 위해, 그림 3은 4시간 동안 TNFα(50 ng/mL)에 노출된 THP-1 대식세포로부터의 MET 방출을 나타내는 대표적인 데이터를 나타낸다. 이 경우, 세포의 비편분화 집단이 사용되었고, THP-1 단핵구는 앞서22일설명한 바와 같이 PMA(72h에 대한 50 ng/mL)로 전처리하여 대식세포로 분화되었다는 점에 유의해야 한다.

그림 1: 분별적으로 편광된 HMDM의 형태학적 변화. 비차별화 및 차별화된 HMDM(n ≥5)의 대표적인 브라이트필드 이미지. HMDM은 IFNγ 및 LPS 또는 IL-4에 노출시 각각 48시간 규모의 바 = 200 μm에 대한 M1 또는 M2 표현형을 프라이밍하기 전에 8일 동안 인간 혈청 및 글루타민을 함유하는 완전한 배지로 배양되었다. 화살표는 M1 또는 M2 HMDM의 형태학적 특성을 나타내는 셀의 예를 나타냅니다.

도 2: HOCl, PMA, IL-8 및 TNFα 자극에 이어 M1 HMDM에 의해 생성된 MET. SYTOX 녹색 염색 HMDMs의 대표적인 이미지는(A)염증 자극이 없는 상태에서 24시간 동안 배양된 비자극 M1 및 M2 HMDMs로부터의 대조군으로서 사용되었고, MET 방출의 부재를 입증하였다. (B)M1 및 M2 HMDMs를 1) HOCl(200 μM, 15 분), PMA (25 nM), 또는 IL-8 (50 ng/mL)을 24 h 또는 2) TNFα (25 ng/mL)를 인큐베이션하여 MET 방출을 유도하여 처리하였다. MET는 M1 HMDM의 상부 패널에 흰색 화살표로 표시된 SYTOX 녹색을 추가하여 시각화되었습니다. M2 HMDM을 가진 상응하는 실험에서 METS가 보이지 않았다. 데이터는 n ≥3 개별 기증자로부터의 복제 배양 웰을 대표한다. 배율 막대 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: TNFα 자극에 따른 비편분화된 THP-1 대식세포에 의해 생성된 MET. SYTOX 녹색 염색 TNP-1 대식세포의 대표적인 이미지는, MET 방출을 유도하기 위해 TNFα(50 ng/mL)의 부재 또는 존재 시 4시간 동안 추가 배양 전에 PMA(72시간 동안 50 ng/mL)로 전처리하여 분화하였다. MET는 SYTOX 그린을 추가하여 시각화되었습니다. 데이터는 n ≥ 3 실험에서 복제 배양 웰의 대표적인. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.