방법 논문

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

DOI:

10.3791/60542

⸱

2020년 4월 24일

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1Laboratory for Angiogenesis and Ocular Cell Transplantation, University of Lübeck, 2Department of Ophthalmology, University of Lübeck, 3Institute of Biomedical Optics, University of Lübeck

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

초록

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Nd:YAG 레이저는 지금 수십 년 동안 capsulotomy와 같은 비침범성 안구 수술을 수행하는 데 사용되었습니다. 절개 효과는 레이저 초점의 광학 고장에 의존합니다. 음향 충격파와 캐비테이션 버블이 발생하여 조직 파열을 일으킵니다. 기포 크기와 압력 진폭은 펄스 에너지와 초점 위치에 따라 달라집니다. 본 연구에서, 핵핵 돼지 눈은 시판되는 Nd:YAG 레이저 앞에 위치시켰다. 가변 펄스 에너지뿐만 아니라 각막에 대한 초점 반점 후방의 상이한 위치를 시험했다. 결과 병변은 최소한의 부수적 손상으로 각막 내피 세포 (CEC)의 독점적 인 분리를위한 최상의 매개 변수를 결정하기 위해 2 광자 현미경 검사법과 조직학에 의해 평가되었다. 이 방법의 장점은 CEC의 정밀한 절제, 감소된 부수적 손상, 그리고 무엇보다도 비접촉 식 치료입니다.

서론

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각막의 투명성은 망막과 광수용체에 빛의 투과에 필수적이다1. 이와 관련하여, 탈수의 상대적인 상태는 각막 기질 내의 콜라겐 섬유를 정확하게 정렬시키는 데 중요합니다. 이 항상성은 Descemet의 막에 있는 각막 내피 세포 (CEC)에 의해 유지됩니다 (DM)2. 내피는 가장 안쪽 각막 층입니다. 그것은 각막 투명성에 중요한 장벽과 펌프 기능을 가지고3. 상피와는 달리, 내피는 자기 갱신 할 수 없습니다4. 따라서 질병 이나 외상으로 인한 임의의 세포 손상은 남은 내피 세포를 자극하여 확대 및 마이그레이션하고, 그로 인한 결함을 커버하고 각막 기능을 유지한다5. 그러나 CEC 밀도가 임계 값 이하로 떨어지면 내피의 부전이 발생하여 시력이 흐려지고 불편함이 생기거나 심한통증이 발생합니다 4. 증상을 완화하는 약물의 가용성에도 불구하고, 현재 이러한 경우 유일한 확실한 치료는 각막 이식이며, 이는 전체 두께 이식 또는 라멜라 내피 이식의 형태로 수행 될 수 있습니다. 후자의 절차는 Descemet의 막 내피 각막 각질 성형술 (DMEK)뿐만 ....

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프로토콜

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동물 조직과 관련된 모든 절차는 지역 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 장기 배양 및 레이저 치료 준비

  1. 현지 아바토이르에서 갓 핵을 얻은 돼지 눈을 얻으실 수 있습니다. L-글루타민, 피루비테 나트륨, 페니실린/스트렙토마이신(1%), 돼지 혈청(10%)으로 보충된 높은 포도당으로 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 시원하게(4°C) 유지하고, 돼지 혈청(10%)을 이 기사에서 전체 배지로 지칭합니다.
  2. 가위로 세포 외 조직을 제거하고 사용할 때까지 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS)에 넣기 전에 5 분 동안 5 % 포비도 요오드 안과 용액에 눈을 담그십시오.
  3. 각막 흉터, 부종 및 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치(재료표)와같은 주요 전방 세그먼트 병리에 대한 화면 눈.
  4. 1,064 nm의 파장과 10 μm의 초점 공대 직경을 가진 Nd:YAG 레이저(재료 표)가장착 된 슬릿 램프 장치 앞에 눈을 배치하십시오.
    참고 : 최적의 위치 지정을 위해 3D 인쇄 된 홀딩 장치가 사용되며, 이는 너무 많은 압력을 가하지 않고 눈을 단단히 고정하도록 설계되었습니다

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결과

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여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 Nd:YAG 레이저로 눈을 치료하고, 다른 펄스 에너지 (1.0-4.6 mJ)와 초점 의 위치 (각막의 후방 표면에서 의 거리 : 0.0-0.2 mm)를 평가하여 최적의 매개 변수를 찾습니다. 다중 복제(n=3)는 레이저 파라미터(12 x 21)의 각 별자리에 대해 평가되었다.

전술한 프로토콜 이외에, 시편은 고정 및 H&E 염색 전에 2광자 현미경으로 분석되었다. 2광자 현미경은 690-1b040 nm의 튜닝 범위와 800 nm에서 800 nm의 평균 레이저 출력을 가진 고체, 모드 잠금 80 MHz Ti: 사파이어 레이저를 사용했습니다. 그것은 샘플에 약 150 fs의 폭으로 펄스를 전달했다. 730 nm 및 30 mW의 레이저 전력파장에서 현미경 대물량(20x/0.95)으로 이미지를 촬영했습니다.

2 광자뿐만 아니라 가벼운 현미경 이미지는 실험 설정에 눈이 멀고 (1) 손상 없음.......

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토론

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이 파일럿 연구의 결과는 Nd:YAG 레이저가 에너지 용량 및 초점 포인트 위치에 대한 적절한 매개 변수가 선택적으로 각막 내피 세포를 ablate하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.

내피 기능은 각막 투명성과 기질 부종에서 각막을 보호하기 위해 중요하기 때문에, 내피 기능 장애의 모델은 항 부종 약물 이나 외과 적 절차의 개발에 중요한 역할을한다. 생체 내 상황10,,14,,15를모방하기 위한 몇 가지 확립된 시험관내 모델이 있지만, 일반적으로 공지된 바와 같이, 시험관내 모델은 효소 및 사이토카인의 영향 또는 세포-세포 상호작용의 효과를 완전히 모방할 수 없다. 대조적으로, 내피 세포 손실의 이 새로 개발된 생체 내 비보 모델은 자연 환경에서 질병의 상이한 상태 및 각막 하보상을 모니터링할 수 있는 가능성을 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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실험적인 방법에 도움을 주신 크리스틴 외룬과 얀 A. M. 소추렉에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
저온 유지 장치LeicaCM 3050S
Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 - 고포도PAAE-15009
아이 홀더자체N/A
도립 현미경LeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG 레이저Zeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
페니실린-스트렙토마이신Sigma-AldrichP4333
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco10010056
돼지 혈청Sigma-Aldrich12736C
스펙트럼 도메인 광간섭 단층촬영Heidelberg EngineeringSpectralis
조직 배양 플레이트 12-wellSarstedt833921
Two-Photon MicroscopeJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel
당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative ....

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재인쇄 및 허가

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태그

Nd YAG

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