이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
생활은 세포와 세포기관 내부의 뚜렷한 분자 상태의 분리된 형성을 허용하기 위하여 지질 막 내의 공간적으로 분할됩니다. 세포 융합은 단일 세포를 형성하기 위해 2개 이상의 세포를 합병하는 것이다. 여기에서 우리는 2개의 다른 세포 모형의 세포 융합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 융합된 하이브리드 세포는 유세포분석 기반 선별에 의해 농축되고, 하이브리드 세포 구조 및 기능의 형광 현미경 검사법에 이어 풍부하다. 게놈 편집에 의해 생성된 형광 태그가 붙은 단백질은 융합된 세포 안쪽에 심상하게, 세포 구조물이 형광 방출에 근거를 둔 확인되고 기원의 세포 모형에 다시 참조되는 것을 허용합니다. 이 강력하고 일반적인 방법은 기본적인 생물학 질문의 범위에 걸쳐 세포 구조 및 기능을 이해하기 위하여 관심있는 다른 세포 모형 또는 세포기관에 적용될 수 있습니다.
서론
세포 구조의 적시성 유지는 삶에 매우 중요합니다. 세포에는 특징적인 형태, 세포 소기관 수 및 내부 생화학 적 조성이 있습니다. 이러한 근본적인 특성이 어떻게 생성되는지, 그리고 질병 중에 어떻게 엉망이 되는지 이해하려면 실험실 도구가 필요합니다.
세포 융합은 2개 이상의 분리된 세포의 병합이다. 세포 융합은 진핵 생명의 출현에 중요했을 수 있습니다1. 인체에서 세포 융합은 비교적 드물며, 수정 또는 근육, 뼈 및 태반의 형성과 같은 제한된 발달 상황 및 조직 유형 동안 발생한다2. 이 프로토콜은 세포 구조 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하는 도구로 서, 분별적으로 표지 된 세포기관과 조직 배양 세포 주에서 세포 융합의 유도를 설명합니다.
시험관내 유도 세포-세포 융합은 생물학적 연구 및 질병 치료를 위한 중요한 도구인 단일클론 항체3의생산의 중심이다. 세포 융합은 또한 세포 주기 우호에 관하여 많은 다른 근본적인 세포 생물학 질문을 하기 위하여 이용되었습니다4,aneuploidy5,
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프로토콜
1. 차등 형광 세포 라벨링
- CRISPR Cas9로 유전자 태그 지정
- CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용하여 인간 암 세포주에서 형광 단백질 meGFP 또는 mScarlet-I와 함께 뿌리 줄기 (또는 관심 있는 다른 유전자)를 태그합니다.
참고: 게놈 편집을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서24,25,26을다룹니다.
- CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용하여 인간 암 세포주에서 형광 단백질 meGFP 또는 mScarlet-I와 함께 뿌리 줄기 (또는 관심 있는 다른 유전자)를 태그합니다.
- 형광 염료 라벨링
- Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에서 Cal51 인간 암 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 가습된 인큐베이터에서 37°C및 5%CO2로 성장시다.
참고: 세포가 mycoplasma 오염의 부재, 그리고 세포주의 정체성에 대해 정기적으로 검사되도록하는 것이 중요합니다. 배양에서 광범위하게 통과된 세포를 사용하지 마십시오(>15 구절). 세포는 건강하고 기하급수적으로 성장해야합니다. 과소 합류 또는 과잉 합류를 피하십시오.
- Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에서 Cal51 인간 암 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 가습된 인큐베이터에서 37°C및 5%CO2로 성장시다.
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결과
적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 더 높은 형광 신호에 의해 유세포분석 중에 볼 수있다(도 2A). 게이츠는 이중 양성 세포의 선별을 위해 설정되어 있으며, 이 집단을 이미징 접시에 직접 풍부하게 하여 추가적인 현미경 분석을 제공합니다. 융합된 세포는 뚜렷한 이중 형광 양성 세포로서 검출가능하며 인구의 약 ~1%를 구성한다.
융합은 두 세포를 하나로 혼합하여 세포 아키텍처의 주요재배열을유도한다(그림 2B). 헤테로카리온은 현미경에서 단일 세포 내부에 혼합된 형광 염료 신호를 모두 포함하는 세포로 확인됩니다(혈장 막을 개입하지 않고). 추가적으로, 2개의 핵은 밝은 필드/차동 간섭.......
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토론
우리는 세포를 융합하고 현미경 검사법으로 세포 하이브리드의 후속 아키텍처를 시각화하기 위한 효과적이고 비용 효율적인 프로토콜을 시연하며, 처음부터 끝까지 약 2일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 세포 선별 (프로토콜 섹션 3)에 의한 융합 세포의 농축 및 현미경 검사법에 의한 융합 세포의 신중한 검증 (프로토콜 섹션 4)입니다. 이 단면도는 융합한 세포가 쉽게 장악되고 선의의 이종인 것을 보장합니다. 농도 및 배양 시간은 준수해야합니다. 예를 들어, 더 높은 농도에서 또는 더 긴 배양 시간에 사용될 때, 세포 염료는 너무 밝고 유세포 분석 또는 형광 현미경 검사법 도중 검출기를 포화시킬 수 있고, 화상 진찰 조건에 따라서 교차 방출을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 유세포계가 없는 경우, 이중 항생제선택(27) 및 미세유체 트래핑장치(28)를포함하는 융합 세포를 풍부하게 할 수 있는 다른 기술들이있다. 그러나 이러한 기술은 느리거나.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 R.M.에 웰컴 트러스트 헨리 웰컴 펠로우십에 의해 투자되었다 (https://wellcome.ac.uk/grant 번호 100090 / 12 / Z). 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다. 아쇼크 벤키타라만과 폴 프렌치가 프로젝트에 대한 중요한 조언과 안내를 해주신 것에 감사드립니다. 우리는 우수한 지원을위한 케임브리지 연구 흐름 세포 측정 시설에 대한 케임브리지 연구소의 키아라 코세티와 가브리엘라 Grondys-Kotarba 감사합니다. 리암 카시데이, 토마스 밀러, 지안마르코 콘티노에게 원고를 증명해 주신 것에 대해 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15mL 튜브 | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% 포름알데히드 용액 | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 레이저 스캐닝 컨포칼 에어리스캔 현미경 | Carl Zeiss | ||
| 8웰 이미징 접시 | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP 알파카 GFP 부스터 나노바디 | Chromotek | gba-488 | |
| BD 유입 Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 세포 필터 (70 μ m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I 알파카 나노바디 | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 독립 이미징 매체 | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| 인산염 완충 식염수(1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O 최대 1L | ||
| 폴리에틸렌 글리콜 Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| 폴리프로필렌 튜브 | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | 비이온성 계면활성제 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | 비이온성 세제 |
참고문헌
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
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