방법 논문

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

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DOI:

10.3791/60599

⸱

2020년 2월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

초록

슈도모나스 녹농균(P.aeruginosa)은특히 당뇨병 및 입원 환자에서 만성 상처 감염의 설정에서 인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가시키는 주요 항균 병원체이다. 상처 병인의 조사와이 병원체에 대한 새로운 치료법의 개발을 돕기 위해 만성 감염 모델이 절실히 필요합니다. 여기서, 우리는 전체 두께 의외감 후 24시간 지연된 접종을 사용하는 프로토콜을 기술한다. 이 때 존재하는 잠정적인 상처 매트릭스의 감염은 감염의 급속한 통관 또는 보급을 포리스트로 하고 대신 이물질 또는 면역 억제의 이식의 필요 없이 7-10 일 지속되는 만성 감염을 설치합니다. 이 프로토콜은 인간에 있는 수술 후 감염의 전형적인 시간적 과정을 모방합니다. 발광 P. aeruginosa 긴장의 사용 (PAO1:lux) P. aeruginosa 상처 감염에 대 한 세균 성 부담의 정량적 매일 평가 에 대 한 허용. 이 새로운 모형은 만성 P. aeruginosa 상처 감염을 위한 세균성 병인 그리고 새로운 치료의 발달의 조사에 있는 유용한 공구일지도 모릅니다.

서론

슈도모나스 aeruginosa (P. aeruginosa)인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가와 그람 음성 막대 모양의 박테리아입니다. 그것은 면역 손상환자에서특히 상처 감염을 포함, nosocomial 설정에서 광범위한 사망률과 사망률에 대한 책임이1,2. 이 병원체의 다제내성 균주의 출현은 P. aeruginosa 독성, P. aeruginosa 항생 저항의 기계장치 및 이 치명적인 감염의 예방 및 처리를 위한 새로운 방법에 기여하는 요인에 대한 조사를 위한 추가 자극을 제공했습니다3. 이와 같이, 이러한 연구 질문을 조사 하기 위한 도구로 만성 상처 감염의 동물 모델에 대 한 필요성은 그 어느 때 보 다 더 큰 되었습니다.

불행하게도, P. aeruginosa 감염의 많은 동물 모델은 패혈증4,5로인한 감염의 급속한 해상도 또는 급속한 감소로 급성 감염을 시뮬레이션하는 경향이 있으며, 이는 이러한 감염의 종종 만성 적 특성을 적절히 시뮬레이션하지 못한다. 이러한 단점을 해결하기 위해 일부 모델은 한천 비드, 실리콘 임플란트 또는 알긴산 겔6,7,8과같은 이물질의 이식을 활용한다. 다른 모델은 고령, 비만 또는 당뇨병으로 인해 면역 손상되는 마우스를 사용하거나, 사이클로포스파미드 유도 호중구 감소증9,10,11,12와같은 약리학적 수단을 통해 사용한다. 그러나, 외국 물자 또는 면역 손상된 호스트의 사용은 가능성이 그렇지 않으면 일반적인 면역 계통을 가진 호스트에 있는 만성 상처 감염에서 관련시킨 병리생리학의 이해를 얻기 어렵게 만드는 현지 선동적인 프로세스를 변경합니다.

우리는 절제 상처 후 박테리아와 지연 접종을 포함 하는 쥐에 P. aeruginosa 상처 감염의 만성 모델을 개발 했습니다. 연기된 접종은 적어도 7 일까지 연장하는 세균성 부담을 평가하는 실험을 허용합니다. 이 모형은 P. aeruginosa 만성 감염의 병인 그리고 새로운 처리 둘 다 조사하기를 위한 새로운 기회를 엽니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 박테리아의 준비 와 성장

  1. 연구원의 기관 생물 안전 위원회 및 동물 사용 위원회 지침에 따라 BSL-2 예방 조치와 P. aeruginosa 및 동물과 함께 모든 작업을 수행. 마우스 접종을 포함하여 P. aeruginosa와관련된 모든 단계를 생물 안전 성 캐비닛에 수행하십시오.
  2. P. aeruginosa의 발광 PAO1:lux 변형은 요청에 따라 저희 실험실에서 구할 수 있습니다. 리소제니 브로스 (LB) 한천에 냉동 글리세롤 스톡으로 보관된 Streak PAO1. 발광 PAO1:lux 변형의 경우, LB 한천은 선택적 항생제 (100 μg / mL 카베니실린 및 12.5 μg / mL 카나마이신)를 포함해야합니다. 세균 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 자랍니다.
  3. 분리된 콜로니를 선택하고 3 ml LB 배지, pH 7.4에서 37°C에서 하룻밤 동안 성장한다. 발광 균주의 경우, 국물은 100 μg / mL 카베니실린을 포함해야합니다. 흔들림, 에어로빅 조건하에서 자랍니다.

2. 절차 준비

  1. 수술을 수행하는 모든 직원이 깨끗한 가운 / 실험실 코트, 얼굴 마스크, 헤어 그물 및 장갑을 착용하게하십시오.
  2. 가위와 집게를 포함한 모든 수술 도구를 오토클레이브합니다. 무균 기술을 사용하여 동물 사이의 도구를 살균하십시오.
  3. 에탄올로 수술 테이블을 청소하고 깨끗한 수술 장을 준비하십시오.

3. 제모

  1. 1%-3% 이소플루란을 사용하여 8-12주 된 C57BL/6J 마우스를 마취시다. 조사관은 isoflurane를 사용할 때 마취에 대한 기관의 수의학 직원 지침을 따라야합니다.
    1. 마취를 시작하여 1%-3% 이소플루란을 제공하고 산소 유량을 1.5L/min로 조정합니다.
    2. 마취의 깊이를 평가하기 위해 마우스의 발가락을 꼬집습니다. 마우스가 더 이상 자극에 반응하지 않는 경우, 유도 챔버에서 제거하고 이소플루란 코 콘에 코와 수술 벤치에 배치.
    3. 두 눈에 안구 윤활제를 바르습니다.
  2. 베이스라인 사전 프로시저 무게를 얻기 위해 마우스를 무게.
  3. 마우스를 취약한 위치에 놓습니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.
  4. 전기 면도기로 마우스의 등가 부위를 면도합니다. 면도는 상처의 모발 오염을 방지하기 위해 수술 실과 다른 위치에서 발생해야합니다.
  5. 제모 로션의 얇은 층을 적용합니다. 로션을 20-60s. 따뜻한 물에 적신 거즈로 머리카락과 과도한 로션을 제거하십시오. 제모 후, 절제 상처 절차를 진행하십시오.

4. 전체 두께 절제 상처 수술

  1. 마우스의 중간 등쪽 영역에서 25 G 바늘을 사용하여 서지속 방출 buprenorphine 0.6-1 mg/kg을 피하 주사. 느린 방출 buprenorphine 이상 통증 완화를 제공 48-72 시간.
  2. 수술 부위를 소독하십시오. 멸균 베타딘 면봉으로 등지 표면을 닦으소. 멸균 알코올 면봉으로 여분의 베타딘을 닦으소서. 이것은 3 번 (베타 딘과 알코올 을 번갈아 가며) 중앙에서 가장자리로 이동하여 스와핑해야합니다. 공기가 건조되도록 하십시오.
  3. 멸균 거즈 또는 플라스틱 집착 랩을 사용하여 수술 부위를 둘러싼 드레이프를 만듭니다.
  4. 스트레칭 피부 팽팽한 caudally. 멸균 6mm 직경의 피부 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 등쪽 표피를 통해 초기 절개를 합니다. 오른쪽 등도 표피에 반복합니다.
  5. 포셉을 사용하여 왼쪽 윤곽이 있는 상처 부위의 중앙에서 피부를 텐트로 막습니다. 가위를 사용하여 표피와 진피 층을 절제하십시오. 오른쪽 윤곽이 있는 상처 부위에서 반복하여 대칭적인 절제 상처를 만듭니다.
  6. 멸균 식염수 50 μL로 상처를 씻으소서. 수술 부위와 주변 피부가 공기 건조되도록 하십시오. 그런 다음 상처와 도르섬을 투명 필름 드레싱으로 덮습니다.
  7. 깨끗한 케이지에 마우스를 다시 놓습니다. 케이지 당 1 개의 동물을 집.
  8. 가열 패드에 케이지를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 모니터합니다.
  9. 여러 동물에 위의 수술을 수행 할 때, 동물 사이의 모든 수술 기구를 청소하는 뜨거운 비드 소독기를 사용합니다.
  10. 마우스가 수술 절차에서 회복하고 박테리아와 접종을 진행하기 전에 상처 위에 임시 상처 매트릭스의 형성을 위해 24 시간 허용.

5. P. aeruginosa와 접종

  1. 하룻밤 PAO1:lux 배양을 OD600 = 0.05 lb 배지의 75 mL에서 100 μg/mL카르베니실린을 함유하고 배양이 초기 기하수계 단계에 있을 때까지 박테리아를 성장시다(OD600  0.3). 이 약 2-3 시간이 소요됩니다.
  2. PBS에서 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU / mL의 농도로 PAO1 : 럭스를 희석하십시오. 충분한 부피를 보장하고 실험 후 도금을 허용하기 위해 과잉 접종을 준비해야합니다. 시설 간에 운송하는 경우(예: 실험실에서 사육장까지), 누출 방지 상자에 이중 봉쇄를 사용하면 Biohazard로 명확하게 표시되어 있습니다.
  3. 동물 생물 안전 수준 2 (ABSL-2) 승인 된 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 승인 된 개인 보호 장비를 사용하여 P. aeruginosa 및 마우스와 함께 모든 작업을 수행하십시오. 계량 스케일과 같은 재사용 가능한 장비는 오염을 방지하기 위해 클링 랩으로 덮여있어야 합니다.
  4. 위에서 설명한 바와 같이 3 % 이소플루란을 사용하여 마취하십시오. 마우스를 계량하고 무게를 기록합니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.
  5. 마우스의 투명 필름 드레싱이 하룻밤 사이에 벗겨지면 결과있는 딱지를 조심스럽게 제거하고 새 드레싱을 입습니다.
  6. 500 μL 결핵 27 G 안전 캡 주사기를 사용하여 PAO1:lux 서스펜션의 40 μL을 각 상처에 투명 필름 드레싱을 통해 주입합니다. 반대측에서 교차 오염을 방지하기 위하여 다른 마우스는 비 접종/PBS 상처 통제를 위해 이용되어야 합니다.
  7. 가열 패드의 케이지에 마우스를 다시 놓고 깨어날 때까지 모니터합니다. 모든 마우스는 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 케이지에 개별적으로 보관해야합니다.
  8. 케이지 바닥에 음식 펠릿 사이에 끼어 있는 고칼로리 영양 보충제 페이스트를 제공합니다.
  9. 남은 접종을 사용하여 LB 한천 접시를 줄무늬로 놓습니다. 투여 된 박테리아의 수를 확인하기 위해 식민지를 계산합니다.

6. 감염된 상처의 생체 내 이미징

  1. 보조 용기 사용을 포함하여 이미징 기기에서 마우스를 수송하기 위한 BSL-2 격납 프로토콜을 따르십시오. 유도 챔버 또는 이미징 기기로 마우스를 옮기는 동안 동물 침구를 옮기거나 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
  2. 3.1단계에서 기재된 바와 같이 유도 챔버에서 흡입된 1%-3% 이소플루란으로 마우스의 마취를 유도한다.
  3. 일단 마우스가 마취되면, 이소플루란 코 콘에 코를 가진 광학 화상 진찰 시스템의 화상 진찰 실에 있는 경향이 있는 위치에 놓습니다.
  4. 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
  5. 획득 파라미터는 동시에 이미지화되는 동물의 수와 생물 발광의 강도에 따라 달라집니다. 설정하는 기본 매개변수에는 노출 시간, 비닝, f/stop 및 시야(FOV)가 포함됩니다. 기본 시작 설정은 노출 시간 30초, 비닝 로우(2), f/stop 1.2 및 FOV 25입니다. 연구원의 필요에 따라 필요에 따라 이러한 설정을 조정합니다.
  6. 이미징 프로그램을 사용하여 발광 데이터를 분석합니다(재료 표참조). 발광은 마우스의 컬러 사진에 중첩된 가짜 색 이미지로서 표현될 것이다.
    1. 상처 부위에 관심 영역(ROI)을 생성하고 감지된 평균 플럭스(광자/초)를 측정합니다. 데이터는 광도(광자/초/cm²/스테라디안)로 보고될 수도 있지만 카메라에서 이미징 플랫폼의 거리가 이미징 사이에 일정하게 유지되는 한 플럭스는 충분합니다.
    2. 이미징 플랫폼의 임의 영역에 ROI를 생성하여 배경을 측정합니다. 초분의 배경 광자 수를 뺍니다.
    3. 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
  7. 감염 진행을 추적하기 위해 매일 위에서 설명한 대로 이미징을 수행합니다.

7. 수술 후 관리

  1. 연구원의 IACUC 프로토콜에 의해 설정 된 지침에 따라 마우스를 모니터링 합니다. 우리는 실험이 끝날 때까지 매일, 그 다음 격일로 처음 4 일 동안 모든 마우스를 모니터링합니다. BSC에서 수술 후 처음 4 일 동안 하루에 한 번 마우스를 무게. 감염 후 1일과 2일에 0.9% 염화나트륨 250 μL을 피하주사합니다.
  2. 구치진 자세, 처진 털, 혼수, 호흡 곤란, 안면 찡그린 얼굴, 체중 감소를 포함하여 마우스의 통증/고민 징후를 확인합니다.
  3. 동물이 건강이 악화되는 징후를 보이는 경우 수의사와 상의하십시오. 통증/고민의 악화 징후와 20% 이상의 체중 감소를 보이는 마우스는 안락사되어야 합니다.

8. 상처 절제

  1. 실험의 끝에서,CO2 흡입을 사용하여 마우스를 희생하고, 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 기관의 ABSL-2 프로토콜에 따라 동물 시체를 폐기하십시오.
  2. BSC에서 멸균 가위와 집게를 사용하여 상처 베드를 절제하십시오. 각 상처 베드를 1mL 멸균 PBS에 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브에 놓습니다. 상처 조직을 가위로 잘라내소. 모든 상처는 감염된 것으로 간주되지 않더라도 ASBL-2로 치료해야합니다.
  3. 4 °C에서 2 시간 동안 300 rpm에서 셰이커에 인큐베이션합니다. 10 s에 대 한 각 튜브를 소용돌이 하 고 연속적으로 PBS에서 세균 유출물을 희석. LB 한천에 희석된 세균 유출물을 플레이트하여 세균 부담을 열거한다.
  4. 상처의 발광 신호가 배경 발광 이상이고 더 많은 박테리아가 PBS로 접종 된 상처보다 상처 유출물에서 발견되면 감염된 상처를 고려하십시오.

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결과

luxABCDE 리포터 시스템(PAO1:lux)을 코딩하는 플라스미드와 함께 PAO1의 발광 균주를 사용하여, 우리는 마우스에 절제상처를 수행하고, 플랑크토닉 P. aeruginosa 24 시간 후에 이러한 상처를 접종하고, 시간이 지남에 따라 세균 부담을 측정하였다(도1 및 그림 2). 이미징 광학 시스템을 사용하여 얻어진 대표적인 이미지는 이러한 모델이 검출 가능한 발광을 초래한다는 것을보여준다(도 3A). 감염은 3일째에 정점에 이르렀고 생물 발광 및 식민지 수모두에 기초하여 7일 후 접종 을 지속하였다(그림3B-C). 이 모델을 사용하여 박테리아의 변형과 마우스 배경에 따라 7...

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토론

우리는 새로운 지연 접종 P. aeruginosa 상처 감염 모델을 개발했습니다. 절제 상처 후 24 시간까지 박테리아와 접종을 연기하는 전략은 1 주 기간 동안 상처 감염의 평가를 가능하게합니다. P. aeruginosa의발광 균주를 사용하여 감염 과정 전반에 걸쳐 감염 진행을 추적 할 수 있습니다. 다른 P. aeruginosa 감염 모형에 비해 감염의 더 긴 과정은 P. aeruginosa 상처 감염을 표적으로 하는 호스트 병원체 상호 작용 및 새로운 치료를 공부를 위한 새로운 기회를 허용할 것입니다. 예를 들어, 우리는 이미 P. aeruginosa가 숙주 면역 계통14를회피하는 것을 허용하는 항바이러스 면역 반응을 자극하는 Pf 박테리오파지의 역할을 입증하기 위하여 이 모델을 이용했습니다.

절제 상처 수술과 세균 접종 사이의 회복 시간 24 시간을 ...

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공개 사항

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이익이 없습니다.

감사의 글

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 발광 구조 벡터는 J. 하디의 은혜로운 선물이었습니다. 회로도는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 우리는 상처 감염 모델에 대한 조언에 대한 G. Gurtner의 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 그의 기술 적 전문성에 대한 비보 이미징의 혁신을위한 스탠포드 센터에서 T. Doyle 감사합니다. 이 작품은 보조금 R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, 스탠포드 SPARK에서 보조금, 포크 의료 연구 신탁 및 낭포성 섬유증 재단 (CFF) P.L.B. C.R.D에 의해 지원되었다 T32AI070에 의해 지원되었다. 과학 및 공학에 대한 개빌란 스탠포드 대학원 펠로우십과 루버트 스트라이커 바이오-X 스탠포드 학제 간 대학원 동호회는 J.M.S를 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨 주사Hospira2484457
18 G x 1 멸균 바늘BD305195
25 G x 1 1/5 멸균 바늘BD305127
알코올 면봉BD326895
Aura 이미징 소프트웨어스펙트럼 기기 이미징해당 없음
BetadinePurdue Frederick Company19-065534
부프레노르핀 SR LABZoopharm해당 없음
C57BL/6J 수컷 마우스The Jackson Laboratory000664
일회용 생검 펀치, 6mmIntegra33-36
파인 가위 - 텅스텐 카바이드파인 사이언스 도구14568-09
유리 구슬 건조 살균기하버드 장치61-0183
과립 한천Fisher BioReagentsBP9744
가열 패드Milliard804879481218
인슐린 주사기(28G 바늘포함) BD329461
Lago X 이미징 시스템스펙트럼 기기 이미징n/a
LB 육수Fisher BioReagentsBP1426
Leur-Lok 1mL 주사기BD309628
Mini Arco Animal TrimmerWahl Professional919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby OilChurch and DwightN/A모든 약국에서 구할 수
팔각형 집게Fine Science Tools11041-08
페트리 접시Falcon351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1xCorning21-040-CV
프레스 및 씰 클링 랩Gladn/a
SafetyGlide 인슐린 주사기(30G 바늘BD포함) 305934
Safetyglide 인슐린 주사기, 1/2mL, 30G x 5/16 TWBD305934
스케일Ohaus Scout ProSP202
보조 영양 보충제Henry Schein 동물 건강29908
테가덤, 6cm x 7cm3M1624W
있음

참고문헌

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
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  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
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  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

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