유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

전사체는 주어진 시간 및 특히 환경 및 성장 조건에서 유기체의 게놈에 의해 발현되는 리보핵산(RNA) 전사체의 완전한 세트를 나타낸다. 각 세포에는 그것의 현재 생리학 및 신진 대사 상태를 반영하는 그것의 개별 적인 전사체가 있습니다. 유사한 조직 또는 기관에서 유래한 세포의 집합은 전형적인 전사체 연구에서 사용되지만, 단세포 및 공간적으로 해결된 전사체학은 인기를 얻고 있다^1. 전사성 분석은 특정 시점 및 정의된 성장 조건에서 선택된 조직에서 전체 RNA를 추출하는 것으로 시작합니다. 이를 위해, 시리얼 종자^2와같은 전분 또는 당도가 높은 샘플로부터 총 RNA를 추출하기 위해 새롭게 개발된 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 견본 중 전사체의 비교는 다른 풍부를 가진 RNA 분자의 확인에서 유래합니다. 이 RNA 분자는 분분하게 발현된 유전자 (DEGs)로 간주됩니다. 특정 마커 유전자로부터 유래된 풍부한 전사체는 발달 상태를 추정하거나 환경 변동에 대한 유기체의 반응을 결정하는 데 사용될 수 있다. 연구 하에 발달 시간 점에 걸쳐 그들의 전사체 풍부에 있는 검출 가능한 변경이 없는 유전자는 수시로 참조 또는 하우스키핑 유전자로 이용됩니다.

RNA는 전형적으로 북부 블로팅 및 정량적 역염합효소 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)과 같은 다양한 방법에 의해 검출되고 정량화되지만, 현재의 고처리량 전사체 는 마이크로어레이 기술뿐만 아니라 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 이용한 핵산 혼성화에 크게 의존한다. RNA-Seq는 다른 곳에서 검토된 바와 같이 높은 처리량 전사체 애플리케이션에 대한 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 현재 매우 인기가^있다3,4. 이전 기술이지만, 마이크로어레이 칩을 이용한 유전자 발현 프로파일링은 생물정보학에 대한 배경 지식이 적게 필요한 더 확립된 기술이기 때문에 여전히 널리 사용되고 있습니다. RNA-Seq에 비해 마이크로어레이 실험에서 생성된 데이터 세트는 더 작고 분석하기 쉽습니다. 또한, 특히 큰 샘플 수를 처리하는 경우 비용 효율적입니다. 우리의 실험실에서는, 우리는 일상적으로 마이크로어레이 기술을 사용하여 전사학 분석을 사용하여 곡물^{,5, 6,67,78,,9의}성장, 발달 및 신진 대사에 관여하는 분자 네트워크 및 경로를 제어하는 중앙 규제 허브의 역할을 결정합니다.⁵ 우리는 또한 정기적으로 비생물성 스트레스^10에곡물 곡물의 반응의 기계론적 이해를 얻기 위해 게놈 전체 유전자 발현 프로파일링 연구를 수행하기 위해, 뿐만 아니라 전사체 전체 협회 (TWAS) 및 시리얼 곡물 품질과 영양에 대한 책임 있는 유전자를 식별하기 위한 연계 매핑 연구의 수행^11,,12. 다른 그룹은 또한 보리 13, 쌀^,14,15,16,사탕수수^17,및 밀^18에서개발 특이적 유전자 발현 아틀라스를 제공하는 마이크로어레이 기술을 사용했다.^14,

이 출판물의 목적은 애질런트 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 시리얼 곡물의 전사 프로파일링을 위해 현재 실험실에서 사용하는 방법에 대한 간략한 텍스트 요약 및 자세한 시각적 설명을 제공하는 것입니다. 다른 마이크로어레이 플랫폼을 사용할 수 있지만 이 방법에서는 다루지 않습니다. 우리는 시리얼 씨앗을 개발하거나 발아시키는 RNA 추출에 대한 자세한 설명을 제시하여 프로토콜을 시작합니다. 우리의 경험에 기초하여, 시리얼 종자 조직을 사용할 때 다운스트림 전사성 분석에 대한 높은 품질및 높은 수량의 전사체를 획득하는 것은 종종 병목 현상이다. 우리는 몇몇 상업적으로 유효한 RNA 추출 키트를 시도했습니다, 그러나 아무도 만족스러운 결과를 제공하지 않았습니다. 따라서, 우리는 시판되는 키트를 사용하여 컬럼 정제를 실시한 후 조 RNA 추출물을 얻기 위해 화학 적 추출 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 전사체 프로파일을 생성하기 위해 상이한 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있는 고품질 RNA^2(그림 1)를정기적으로 그리고 재현가능하게 얻는다.

1. 총 RNA 추출 및 정제

참고 : 이 방법은 유해한 휘발성 유기 용매의 사용을 포함하기 때문에 항상 연기 후드에서 작동합니다. 실험을 시작하기 전에 50°C 열 블록에서 뉴클레아제 없는 물의 마이크로퍼지 튜브를 미리 데운다. 이 뉴클레아제 없는 물은 1.8단계에서 스핀 컬럼으로부터 총 RNA를 용해시키기 위해 사용될 것이다.

1. 별도로 샘플을 분쇄, 적어도 세 개의 생물학적 복제와 각, 액체 질소에서 미리 냉각되는 멸균 모르타르와 유봉을 사용하여 미세 분말로.
   1. 액체 질소에 담근 작은 금속 주걱을 사용하여 분말 샘플을 떠서 2.0 mL 뉴클레아제없는 마이크로 퍼지 튜브에 분말 샘플을 놓고 액체 질소에 미리 담근. 즉시 배치 RNA 추출 (STOP POINT)에 할당 된 날까지 초저온 냉동고 (-80 °C)에 샘플을 저장합니다.
      참고 : 종자 샘플은 탈수 여부에 관계없이 미세 분말로 분쇄 될 수 있습니다. 쌀의 경우, 껍질에는 분쇄 과정에서 도움이 될 수있는 실리카가 포함되어 있기 때문에 껍질을 벗겨서 샘플을 정기적으로 갈아서 갈아서 먹습니다.
      주의: 이 단계는 엄격하게 극저온 조건하에서 빠르고 수행해야 합니다. 자동화를 위한 한 가지 옵션은 극저온 볼 밀을 사용하여 샘플을 분쇄하여 RNA 분해 및 품질 저하를 최소화하는 것입니다.
2. 원래 분말 샘플의 약 200 mg을 사용하여 원유 RNA 추출물을 얻습니다. RNA 추출 완충액 (100 mMTris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1.5 % SDS, 1.5 % mercaptoethanol) 및 500 μL의 페놀 :250 μl을 포함하는 뉴클레아제없는 마이크로 퍼지 튜브에 개별적으로 추가 : 200 μl : 200 μl : 200 μl.
   1. 고속으로 설정된 멀티 튜브 와류 믹서를 사용하여 실온에서 5분 동안 모든 샘플을 동시에 혼합합니다. 즉시 2 분 동안 얼음에 모든 튜브를 유지합니다.
      주의: 특히 페놀, 클로로포름 및 기타 유기 용매와 관련된 모든 단계에서 항상 연기 후드 내부에서 작용하십시오. 이상적으로는 벤치탑 원심분리기, 와류 믹서, 멀티 튜브 소용돌이 믹서 및 멀티 튜브 로터리 믹서를 수용할 수 있는 넓은 연기 후드를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 10 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리에 의해 파편에서 원유 RNA 추출물을 분리하십시오. 이 섹션에 대해 동일한 설정으로 모든 원심 분리 단계를 수행합니다.
   1. 약 800 μL의 상판을 1.2 M NaCl 및 700 μL의 이소프로판올 400 μL을 함유하는 새로운 2.0 mL 마이크로 퍼지 튜브로 옮김. 5x 반전하여 용액을 부드럽게 섞습니다.
   2. RNA를 일반(-20°C) 또는 초저온 냉동고(-80°C)에서 적어도 1시간(또는 하룻밤)에 침전시한다.
      중지 또는 일시 정지 지점: 샘플을 일반 -20°C 냉동고에 보관하여 몇 시간 동안 일시 중지하십시오. 하룻밤 또는 더 긴 정지 지점을 위해, 초저온 냉동고 (-80 °C)에 샘플을 저장합니다.
4. 15 분 동안 18,800 x g에서 원심 분리에 의해 원유 RNA 펠릿을 얻습니다. 상류물을 폐기한 후, 미니키트(재료표)를사용하여 컬럼 정제에 의해 조RNA 펠릿을 정제한다.
   1. 새로 제조된 450 μL의 RLT 버퍼에 펠릿을 용해시키십시오(사용하기 전에, RLT 완충액 100 mL당 β-메르카포에탄올 100 μL을 추가하고, 매일 신선하게 제조합니다). 모든 튜브를 실온에서 적어도 5분 동안 멀티 튜브 와류 믹서에 혼합하여 모든 펠릿의 용해를 강화한다.
5. 2 mL 수집 튜브로 보라색 미니 스핀 컬럼을 통과하여 용해된 RNA 펠릿을 정화합니다. 9,000 x g에서 실온에서 1 분 동안 원심 분리기를 하고 보라색 미니 스핀 컬럼을 버립니다.
   1. 2 mL 수집 튜브의 클리어 된 용해액에 0.5 부피의 절대 에탄올 (~225 μL)을 추가하십시오. 동일한 플라스틱 팁을 사용하여 용액을 위아래로 몇 번 파이펫팅하여 혼합합니다.
6. 2 mL 수집 튜브가있는 분홍색 미니 스핀 컬럼에 용액을 즉시 전달하여 정제 된 RNA를 수집합니다. 9,000 x g에서 15s에 대한 원심분리기는 분홍분 스핀 컬럼의 실리카 막 상에 RNA를 수집한다. 흐름을 버리고 15초 동안 9,000 x g에서 원심분리하여 350 μL의 버퍼 RW1로 RNA를 세척합니다.
7. 희석된 DNase 1(DNase 세트를 사용하여 RDD의 50 μL + RDD 의 50 μL)을 추가하여 오염된 게놈 DNA를 제거하고 실온에서 최소 15분 동안 배양하여 소화합니다(PAUSE POINT).
   1. RW1 의 350 μL을 추가하고 15 s에 대해 9,000 x g에서 아래로 회전하여 DNase 1을 씻어 내지만 이번에는 버퍼 RPE 500 μL로 씻어 내보시기 합니다. 새로운 2 mL 수집 튜브로 옮기고 9,000 x g에서 2 분 동안 돌리십시오.
8. 건조된 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 뉴클레아제 없는 수집 튜브로 옮김. 정제된 RNA 추출물에 대한 용출 공정을 시작하여 50°C에서 50°C에서 50°C의 무염수 50μl을 첨가하고 50°C의 열 블록에서 3분 동안 배양합니다.
   1. 배양 후, 9,000 x g에서 원심분리하여 총 RNA 추출물을 1 분 동안 용해시. 즉시 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
9. 나노드롭 및 바이오분석기에서 각각의 제조사 프로토콜을 사용하여 적절한 희석(보통 1:10)을 실행하여 총 RNA 추출물의 양과 품질을 결정합니다. RNA 추출물은 적어도 RIN 값이 8.0이고 농도가 50 ng/μL이어야 한다. 도 1은 보리 잎 및 종자로부터 수득된 RNA 추출물에 대한 전형적인 결과를 나타낸다.
   정지 지점: 시료를 사용할 때까지 -80°C에 보관하십시오.

2. cDNA 합성 뒤에 cRNA 전사 및 라벨링

참고: 이 단계는 24개의 샘플을 동시에 처리하는 데 적합합니다. 전체 단계가 하루 만에 지속적으로 수행되는 것이 좋습니다.하지만 선택적 정지 및 일시 중지 지점이 식별됩니다. 아래 단계를 시작하기 전에 80 °C, 65 ° C 및 37 °C에서 3 개의 마이크로 퍼지 튜브 열 블록을 미리 따뜻하게하십시오. 이러한 온도 설정은 아래 단계에 명시된 대로 변경됩니다. 예를 들어, 37°C 열 블록은 스파이크 믹스가 제조된 후 40°C로 설정됩니다(또는 이전에 제조된 경우). 제조업체의 지침에 따라 저입력 퀵 앰프 유전자 발현 라벨링 키트(재료 표참조)를 사용하여 1색 스파이크 믹스, T7 프로모터 믹스 및 cDNA 마스터 믹스를 준비합니다. 이 제제는 시작 RNA 추출물의 양에 따라 달라지며, 이는 보통 총 RNA에 대해 10~200 ng 또는 PolyA RNA에 대해 5ng의 범위입니다. 우리는 마이크로어레이 혼성화^2및 아래에 설명될 방법에 대해 50 ng 총 RNA를 출발 재료로 일상적으로 사용한다. 24개의 샘플에 대한 마스터 믹스를 준비할 때, 파이펫팅 변형을 고려하여 2개의 추가 반응을 추가합니다. 이 단계에서는 항상 뉴클레아제없는 마이크로 퍼지 튜브와 뉴클레아제없는 물을 사용하십시오.

1. 높은 수율로 인해, 전형적으로 RNA 추출물을 50-100 ng 범위 내에 맞게 100배 희석한다. 1.9단계에서의 RNA 정량화 결과에 기초하여, 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 99 μL의 뉴클레아제 함유물에 정제된 RNA 추출물 1 μL을 첨가하여 1:100 희석을 한다. 나노 드롭을 사용하여이 희석의 실제 농도를 결정합니다.
   1. 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에서 각 총 RNA 샘플의 두 번째 희석을 하여 최종 부피 1.5 μL에서 총 RNA 50 ng를 만듭니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 스파이크 믹스를 준비합니다. 이 단계는 또한 Püffeld 외. 2019². 이를 위해 37°C 의 열 블록을 사용하십시오. 1색 스파이크 믹스 포지티브 컨트롤의 제1 및 제2 희석을 초저온 냉동고(-80°C)에 저장하고 8번의 반복된 동결/해동 주기만 거치게 한다.
   1. 매일 세 번째와 네 번째 희석을 신선하게 준비하십시오. 사용 전에 스파이크 믹스의 세 번째와 네 번째 희석을 해동하고 보관하십시오.
      참고: 스파이크 믹스가 준비되었을 때(또는 이전에 제조된 경우) 37°C 열 블록의 온도를 40°C로 변환합니다.
3. T7 프로모터 믹스를 준비하고 사용하기 전에 얼음위에 보관하십시오. 다음은 24개의 샘플에 충분합니다.
   T7 프로모터 프라이머 20.8 μL
   + 26.0 μL의 뉴클레아제 없는 물
   = 총 부피 T7 프로모터 믹스의 46.8 μL
4. 2.1단계에서 50 ng RNA 시료의 1.5 μL을 함유하는 각 마이크로퍼지 튜브에 T7 프로모터 프라이머 믹스(Step 2.3)의 1.8 μL을 첨가합니다. 여러 번 파이펫팅하여 부품을 올바르게 혼합합니다. RNA 템플릿-프라이머 혼합물을 65°C 열 블록에서 10분 동안 배양하여 변성. 즉시 다음 단계를 준비하기 위해 얼음 위에 마이크로퍼지 튜브를 놓는다.
5. 템플릿 프라이머 믹스(Step 2.4)를 변성하는 동안, 적어도 4분 동안 80°C에서 5x 첫 번째 스트랜드 버퍼를 미리 따뜻하게 합니다. Table of Materials 다음은 24개의 반응에 충분합니다.
   52.0 μL의 예온 된 5x 첫 번째 가닥 버퍼 (단계 2.5)
   + 0.1M DTT의 26.0 μL
   + 10 mM dNTP 믹스의 13.0 μL
   + RNase 블록 믹스의 31.2 μL
   = 총 볼륨 cDNA 합성 마스터 믹스의 122.2 μL
   1. 얼음에 각 구성 요소를 해동합니다. 각 구성 요소를 부드러운 파이펫팅으로 혼합합니다. 마스터 믹스를 사용하기 전에 실온에서 보관하십시오.
      주의: RNase 블록 믹스는 사용 후 -20°C 냉동고에 즉시 다시 넣어야 합니다.
6. 얼음 상에서 RNA 템플릿 프라이머 혼합물을 제거하고(Step 2.4) 실온에서 잠시 원심분리기를 제거하고 모든 내용물들을 마이크로퍼지튜브의 바닥까지 스핀다운한다. cDNA 마스터 믹스(Step 2.5)의 4.7 μL을 각 튜브에 분배하고 위아래로 파이펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 모든 구성 요소를 추가할 때의 총 부피는 8.0 μL이어야 합니다.
   1. 40 °C 열 블록에서 2 시간 동안 cDNA를 합성합니다. 2 시간 배양 동안, 열 불활성화에 대비하여 65 °C 열 블록의 온도를 70 °C로 이동합니다 (단계 2.7).
      선택 사항 일시 정지 지점: 샘플을 하룻밤 동안 -80°C에 보관하십시오. 실험은 열 불활성화 후 다음날 계속될 수 있다(단계 2.7).
7. RNase 블록 믹스를 가열하여 15 분 동안 70 °C 열 블록에서 각 튜브를 배양하십시오. 즉시 얼음에 튜브를 전송하고 적어도 5 분 동안 배양.
8. 샘플이 5 분 동안 얼음에있는 동안 (단계 2.7), 신속하게 전사 마스터 믹스를 준비합니다. 모든 구성품은 실온에서 결합할 수 있지만 얼음에 부품을 해동할 수 있습니다. 다음은 24개의 샘플에 충분합니다.
   19.5 μL의 뉴클레아제 없는 물
   + 5x 전사 완충제 의 83.2 μL
   + 0.1M DTT의 15.6 μL
   NTP 믹스 + 26.0 μL
   + T7 RNA 폴리머라제 블렌드 5.5 μL
   + 6.2 μL의 시아닌 3-CTP (Cy3)
   = 총 볼륨 전사 마스터 믹스의 156.0 μL
   주의: T7 RNA 폴리머라제 블렌드는 -20°C 냉동실에 보관하고 사용 직후에 다시 넣어야 합니다. 또한 Cy3는 빛에 민감합니다. 따라서 혼합(단계 2.9) 및 디스펜싱(단계 2.10)은 저조도 조건에서 이루어져야 합니다. 이를 위해, 우리는 일반적으로 실험실 벤치 바로 위에 있는 모든 빛을 끕니다.
9. 튜브가 갑작스러운 가열 및 냉각(Step 2.7)을 거치면서, 각 미세지회 튜브의 바닥에 있는 모든 액체를 수집하기 위해 미세원심분리기를 사용하여 각 샘플의 내용물들을 잠깐 스핀다운하였다. 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 전사 마스터 믹스 6 μL(2.8단계)을 추가합니다. 이 반응의 총 부피는 이 단계에서 16 μL이어야 합니다. 40°C에서 2시간 동안 튜브를 배양하여 Cy3 표지된 cRNA를 생성한다.
   선택적 정지 지점: 튜브는 전사 후 -80°C에서 보관할 수 있다.
10. cRNA(Step 2.9)를 발생시키면서, 열 블록의 온도를 55°C로 설정한다. 열 블록에 뉴클레아제없는 물의 적어도 하나의 마이크로 퍼지 튜브를 추가합니다. 이러한 뉴클레아제 없는 물은 정제된 cRNA의 용출을 위해 사용될 것이다.
11. cRNA 전사 및 라벨링 후, 3단계에서 자세히 설명한 바와 같이 RNeasy 미니 키트를 사용하여 표지된 cRNA를 정제한다.

3. cRNA 정화

1. RNeasy 미니 키트를 사용하여 라벨이 부착된 cRNA를 정화합니다(재료 표참조). 제조업체의 지침에 따라 버퍼를 준비합니다. 예를 들어, 버퍼 RPE는 농축 된 형태로 키트에 공급된다. 사용하기 전에 분자 생물학 등급 절대 에탄올 (96-100 %)의 4 볼륨을 추가하십시오.
2. 각 샘플에 84 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가하여 총 부피를 100 μL로 조정합니다. 그런 다음 버퍼 RLT 350 μL과 절대 에탄올 250 μL을 각 튜브에 추가합니다. 파이펫팅으로 철저히 섞으세요.
3. 각 혼합물의 700 μL을 2 mL 수집 튜브가 있는 미니 스핀 컬럼에 옮니다. 7,534 x g에서30 s에 대 한 4 °C에서 원심 분리에 의해 막에 라벨된 cRNA를 수집 합니다. 유동액체를 버리십시오.
4. 버퍼 RPE의 500 μL에서 각 샘플을 세척합니다. 이전 단계에서와 같이 원심분리기 및 유동을 폐기합니다. 이 단계를 한 번 반복한 다음 다음 단계로 이동합니다.
5. 미니 스핀 컬럼을 새 컬렉션 튜브로 전송합니다. 3.3 단계에서와 같이 원심분리에 의해 샘플을 건조시다.
6. 키트와 함께 제공되는 뉴클레아제 프리 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에 미니 스핀 컬럼을 옮김을 옮김. 각 라벨이 붙은 cRNA 샘플을 멤브레인 필터에 직접 30 μL의 뉴클레아제 없는 물(55°C에서 미리 데운 물)을 첨가하여 용출합니다. 60s동안 55°C 열 블록에서 배양하여 용출을 향상시킵니다.
7. 7,535 x g에서30 s에 대한 실온에서 원심 분리에 의해 표지 된 cRNA를 수집합니다. 스핀 컬럼을 버리고 각 마이크로 퍼지 튜브를 닫습니다. 즉시 얼음에 각 튜브를 놓습니다.
   선택 사양 정지 지점: 용출 후 시료를 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
8. 마이크로어레이 기능을 사용하여 나노드롭으로 cRNA를 정량화합니다. 샘플을 RNA-40으로 설정합니다. 스프레드시트에서 시아닌 3염료 농도(pmol/μL), RNA 흡광도 비율(260 nm/280 nm), cRNA 농도(ng/μL)를 가져옵니다.
   정지 지점: 판독 후 cRNA 샘플을 -80°C에 즉시 보관하십시오.
9. Püffeld 외 2019^2.2. 에 자세히 설명된 바와 같이 cRNA 수율 및 특정 활성을 계산합니다.

4. 마이크로어레이 혼성화 및 스캐닝

참고 :이 단계는 3-4 시간 소요되므로 24 샘플의 혼성화는 점심 식사 후 시작할 수 있습니다. 한 작업자는 최대 4개의 슬라이드(샘플 32개)까지 편안하게 실행할 수 있습니다. 다음 날 아침에는 마이크로어레이 슬라이드를 세척하고 스캔할 수 있습니다. 추가 실행은 두 번째 날오후에 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 모든 샘플이 혼성화되고 스캔될 때까지 반복됩니다. 슬라이드를 취급하고 가공하기 위해 무색 분말 라텍스 장갑을 사용하여 샘플이 마이크로어레이 분석을 방해할 수 있는 착색 안료로 오염되지 않도록 하는 것이 좋습니다. 시판된 마이크로어레이를 제외하고, 다음 의 사용자 정의 배열은 우리의 그룹에 의해 설계 및 애질런트에서 주문 할 수 있습니다 : 주문 코드 028827 보리(Hordeumvulgare),054269 쌀(Oryzasativa subs. Japonica),054270 쌀(Oryzasativa subs. Indica)및 048923Triticumaestivum

1. 유전자 발현 혼성화 키트를 사용하여 마이크로어레이 혼성화를 수행합니다(재료 표참조). 제조업체사양^2에따라 10x 차단제를 준비합니다. 10x 차단제를 200 μL 부분으로 알리쿼트하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오. 각 aliquot는 최대 40개의 혼성화를 위해 충분하며 최대 2개월까지 안정적입니다.
2. 마이크로어레이 혼성화를 위해 할당된 날, 얼음에 10x 차단제의 200 μL aliquot 를 해동합니다. 또한, 혼성화 오븐을 65°C로 미리 온난시키고 cRNA 단편화 시 사용하기 위해 열 블록을 60°C로 미리 가열한다.
3. 제조업체^2에서설명한 대로 각 샘플에 대해 조각화 믹스를 준비합니다. 우리의 실험실에서는, 우리는 8 팩 마이크로어레이에 있는 혼성화를 위해 선형 증폭Cy3 표지된 cRNA의 600 ng를 일상적으로 이용합니다. 이 경우 아래 목록은 샘플당 조각화 믹스의 구성 요소를 요약합니다.
   600 ng의 선형 증폭 cRNA, 시아닌 3 라벨
   + 10x 차단제 5 μL
   뉴클레아제없는 물로 부피를 24 μL로 조정
   + 25x 조각화 버퍼의 1 μL
   = 총 볼륨 조각화 믹스의 25 μL
   1. 와류 믹서를 사용하여 샘플을 부드럽게 섞습니다. 미세 원심 분리기를 사용하여 모든 샘플을 간단히 회전시면 됩니다.
4. 정확히 30 분 동안 60 °C 열 블록에서 모든 샘플을 인큐베이션. 즉시 1 분 동안 얼음에 각 튜브를 냉각 한 다음 신속하게 다음 단계로 진행.
5. 조각화 반응을 완전히 중지하려면 각 튜브에 2x GEx 하이브리드화 버퍼 HI-RPM을 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞고, 혼합 중에 거품을 내주지 않도록 주의하세요. 우리는 정기적으로 8 팩 마이크로 어레이 형식에 대한 단편화 반응을 중지 하이브리드화 버퍼의 25 μL을 사용합니다.
6. 원심분리기 주변 실내 온도에서 15,750 x g에서 1 분 동안 모든 튜브. 모든 튜브를 얼음 위에 빠르게 놓고 각 샘플을 가능한 한 빨리 적재하십시오.
7. 17 시간 하룻밤 배양을 위해 실험실을 떠나기 전에, 비디오에 상세한 바와 같이 혼성화 어셈블리^2를 준비한다.
   1. 중요 단계: 각 혼성화 믹스를 전송하고 각 개스킷의 중앙에 천천히 분배하여 분주 하는 동안 거품이 들어가지 않도록 세심한 주의를 기울이세요. 우리는 8 팩 마이크로 어레이 포맷에 대해 44 μL의 혼성화 믹스를 일상적으로 사용합니다. 또한 사용하지 않은 우물에 1x 하이브리드화 버퍼의 44 μL을 놓습니다.
   2. 즉시 개스킷 슬라이드 위에 올바른 방향으로 마이크로어레이 슬라이드를 놓습니다. 이것은 액체를 흘리지 않기 위해 매우 신중하게 수행해야합니다. 하이브리드화 어셈블리를 단단히 닫고 회전하여 영구 기포가 도입되지 않은지 확인합니다. 모든 기포는 개스킷 슬라이드 내에서 움직여야 합니다.
8. 혼성화 오븐 회전자에 혼성화 챔버 어셈블리를 넣습니다. 2x GEx 하이브리드화 버퍼를 사용하는 경우 회전 속도를 10 rpm으로 설정하고 정확히 17시간 동안 65°C에서 혼성화합니다.
9. 유전자 발현 세척 버퍼 키트를 사용하여 혼성 화된 마이크로 어레이를 세척하십시오 (재료 표참조). 유전자 발현 세척 버퍼 1 및 2 를 제조 하는 제조 업체의 지침에 따라^2. 두 버퍼에 10% Triton X-102의 2 mL을 추가하십시오 (순전히 선택 사항이지만 마이크로 어레이 세척 아티팩트의 발생률을 줄이는 것이^{좋습니다)2}.
10. 이전 간행물^2에자세히 설명된 대로 세 개의 세척 챔버 어셈블리를 준비합니다. 각 세척 챔버의 세부 사항은 아래 표로 표로 표로 되어 있습니다(표 1).
11. Aliquot 500 lL 세척 완충제 1 개 에 1 L 시약 병에 주위 실온에서 둡니다. 1L 시약 병을 추가로 준비하고 "세척 버퍼 1 재사용"으로 라벨을 준비하여 첫 번째 챔버에서 세척 버퍼를 저장합니다. 또한, 시약 병에 세척 완충제 2의 500 mL를 aliquot하고 밤새 37°C 수조에서 배양한다.
    참고: 4.9단계에서 4.11단계까지 준비하지 않고 실험실을 떠나지 마십시오. 다음날 세탁 단계에 필요합니다.
12. 다음날, 표 2에상세히 설명된 대로 세척 버퍼를 준비한다. 각 접시를 해당 버퍼의 3/4로 채웁니다. 각 세척 버퍼는 최대 4-5개의 슬라이드에 적합합니다.
13. 정확히 17 시간 의 혼성화 후, 하나의 혼성화 챔버를 얻고 이전 간행물^2에자세히 설명 된 보풀이없는 종이 줄 지어 실험실 벤치에 분해.
    1. 중요한 단계: 마이크로어레이 샌드위치를 접시 1로 옮김. 마이크로어레이 바코드가 기울어진 위치에 있는지 확인하고 버퍼에서 전체 슬라이드를 잠수하지 않도록 하십시오. 끝에서 각 마이크로어레이 슬라이드를 처리하고 슬라이드의 활성 면을 만지지 않도록 합니다.
    2. 집게^2를사용하여 두 개의 유리 슬라이드를 분리합니다. 개스킷 슬라이드가 접시 1의 바닥에 부드럽게 떨어지게하면서 동시에 마이크로 어레이 슬라이드가 다음 단계를 위해 단단히 고정되도록합니다.
14. 중요 단계: 마이크로어레이 슬라이드를 옆으로 천천히 들어 올리고 이전 간행물^2에자세히 설명된 대로 Dish 2의 마이크로어레이 랙으로 즉시 전달합니다. 마이크로어레이 슬라이드가 공기에 최소한으로 노출되는 것이 중요합니다.
    1. 8개의 슬라이드가 랙에 놓일 때까지 4.13 단계와 4.14단계를 반복합니다. 랙을 따라 마이크로어레이 슬라이드를 균등하게 분배합니다. 이 단계는 최대 4개의 슬라이드에 대해 보조를 받지 않은 한 연산자가 수행할 수 있습니다. 랙 홀더를 부착하고 전체 접시 2 설정을 첫 번째 마그네틱 교반기로 옮김. 정확히 1분간 부드럽게 저어주세요.
15. 1분 동안 교반하면서(단계 4.14), 미니 37°C 인큐베이터로부터 접시 3을 옮기고 제2 마그네틱 교반기 위에 놓습니다. 접시 3에 워시 버퍼 2(37°C 수조)를 부드럽게 놓습니다. 붓는 동안 거품 형성을 피하십시오.
    1. 1분간 교반한 후(4.14단계), 접시 2에서 슬라이드 랙을 부드럽게 들어 올려 접시 3으로 옮김을 옮니다. 랙 홀더를 제거하고 정확히 1분 간 저어줍니다.
16. 디쉬 3에서 슬라이드 랙을 천천히 천천히 들어 올립니다. 버퍼 액적^2의형성을 피하십시오. 각 슬라이드의 측면을 보풀이 없는 용지에 부드럽게 터치하여 말립니다. 각 블롯 건조 슬라이드를 슬라이드 상자에 놓고 모든 마이크로어레이 슬라이드가 슬라이드 상자에 들어갈 때까지 4.16단계를 반복합니다. 약 15분 동안 건조시면 됩니다.
    옵션 정지 지점
17. 각 마이크로어레이 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 바코드가 위를 향하도록 합니다.
    참고: 마이크로어레이 룸 내부의 오존 수준은 50 ppb (100^μg/m3)이하여야 합니다. 이것은 순전히 선택 사항이지만 매우 권장됩니다 : 오존 배리어 슬라이드 커버를 사용하여 오존으로 인한 치아닌 염료의 분해를 피하십시오.
18. 조립된 슬라이드 홀더를 스캔 캐러셀에 넣습니다. 바코드 번호에 따라 샘플을 순서대로 로드합니다. 이전 발행물^2에자세히 설명된 대로 마이크로어레이 스캐너(재료 표참조)를 사용하여 슬라이드를 즉시 스캔합니다.
19. 실행 후, 이전 발행물^2에자세히 설명된 바와 같이, 기능 추출 및 QC 유효성 검사를 위해 데이터를 적용합니다.

이 방법은 상당한 양의 오염 전분 또는 설탕을 포함하는 시리얼 종자 샘플을 추출하는 데 최적화되어 있습니다. 그것은 하루에 24 종자 샘플에서 총 RNA를 추출하도록 설계되었습니다. 하루에 지속적으로 수행해야 하지만 프로토콜 전체에서 선택적 중지 및 일시 중지 지점이 식별됩니다. 대안적으로, 리더는 그들의 바람직한 RNA 추출 키트 또는 수동 화학적 추출 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 우리의 이전 경험에 따라, 상업적으로 사용 가능한 식물 RNA 추출 키트 는 전분, 단백질, 설탕 및/또는 지질 오염의 상당한 금액으로 인해 씨앗에 적합 하지 않습니다. 기재된 방법에서, 원유 RNA의 화학적 추출은 상업적RNA 추출 키트를 이용한 컬럼 정제가 뒤따른다. 이것은 전형적으로 더 높은 질 및 수율을 가진 RNA를 제공합니다. 도 1은 여기에 설명된 방법을 사용하여 RNA 추출의 품질을 테스트하기 위해 BioAnalyzer 실행의 결과를 보여줍니다. 결과는 보리 잎(낮은 전분 함량 샘플을 나타내는 샘플 1 및 2) 및 보리 종자(높은 전분 함량 샘플을 나타내는 샘플 3 및 4)에 대해 제시된다. 모든 샘플에 대한 RNA 무결성(RIN) 값은 10입니다.

도 1은 정제된 RNA 추출물의 대표적인 겔을 나타내며, 여기서 품질은 바이오분석기를 사용하여 시험하였다. 샘플 1과 2는 엽록체에서 추가 rRNA 밴드가 분명한 보리 잎과 같은 낮은 전분 함량 샘플에 대한 전형적인 결과입니다. 시료 3 및 4는 보리 종자와 같은 높은 전분 함량 샘플에 대한 대표적인 결과이며, 18S 및 28S rRNA를 나타냈다. 엽록체 rRNA로 인해 잎 샘플과 같은 녹색 식물 조직에 대해서는 자동화된 RIN 값을 계산할 수 없습니다. 그러나, 무결성 및 높은 품질은 일반적으로 낮은 분자 얼룩으로 나타나는 어떤 분해 제품의 부재에 의해 시각적으로 확인 될 수있다. 보리 종자 와 같은 고전분 종자 샘플에 대한 RIN 값은 전형적으로 이 백서에 기재된 프로토콜을 사용하여 10이다.

또한, 우리는 또한 여기에 맥아 품질19의분석에 사용되는 두 개의 엘리트 보리 근친 선 (소피아라와 빅토리아나)의 시간 과정 실험의 대표적인 데이터를 제시한다. 맥아 처리 중에 전분은 설탕으로 변환됩니다. 따라서, 견본은 전분과 설탕 내용의 다양한 비율을 가진 조직을 나타냅니다. 산업용 맥아 가공공정이 발아 공정과 유사하기 때문에 맥아 품질이 다른 두 보리 라인의 전사체를 분석했습니다. RNA는 생물학적 삼중체에서 의imbibition 후 2, 24, 48, 72, 120, 144 및 196 h에서 발아 씨앗으로부터 추출되었다. 맞춤형 보리 마이크로어레이 칩에 대한 RNA 제제 및 혼성화를 전술한 바와 같이 수행하였다. 도 2는 검출된 신호에 대한 품질 관리(QC)보고서(도 3)및 히스토그램 플롯에 주어진 마이크로어레이 혼성화로부터 판독된 정규화된 그리드를 나타낸다. 그리드는 교정에 사용되는 배경 및 스파이크 인 읽기 점을 포함하여 칩의 각 모서리에서 파생 된 신호의 예를 제공합니다. 히스토그램은 각각의 신호 강도가 있는 검출 가능한 점의 편차를 나타냅니다. 성공적인 혼성화는 그림과 같이 사소한 이상값만 있는 넓은 가우시안 모양의 곡선을 제공합니다. 혼성화가 실패하면 한쪽쪽으로 강한 변화가 생길 수 있습니다("녹색 괴물").

마지막으로, 허용 가능한 값의 대표적인 결과는 그림 3의열 4에 나와 있습니다. 수행된 실험의 신뢰성을 나타내기 위해 GeneSpring 소프트웨어를 사용하여 결과를 추가로 평가합니다. 수집된 데이터는 주 성분 분석(PCA)으로 표시됩니다. PCA는 선택한 점(유전자)의 값을 벡터로 통합합니다. 사용되는 평가된 점의 수는 수백 개에서 전체 칩까지 다양할 수 있으며 사용되는 소프트웨어에 따라 다릅니다. 각 칩(샘플)은 분석된 도트에 대한 통합 신호 강도로부터 초래된 하나의 값(벡터)을 초래한다. 따라서 그래프(PCA)의 상대적 위치는 샘플이 서로 유사성을 나타낸다. 샘플이 가까울수록 더 비슷합니다. 기술 복제는 생물학적 복제보다 더 가까워야 하며, 샘플의 생물학적 복제는 서로 다른 시간 지점, 조직 또는 조건의 샘플보다 서로 더 가깝게 클러스터되어야 합니다.

그림 1: 바이오분석기를 통해 RNA의 품질을 확인한 후 얻은 전기동아 파일 실행 요약. 샘플 1 및 2는 엽록체로부터의 추가리보좀 밴드에 의해 지시된 바와 같이 보리 잎 조직이다. 샘플 3 및 4는 18S 및 28S rRNA 대역을 도시한 보리 종자 조직이다. RIN 인자는 잎과 같은 녹색 조직에 대해 항상 계산되지는 않지만 젤에 따르면 RNA의 품질이 매우 좋습니다. 샘플 3 및 4의 RIN 값은 10입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 성공적인 보리 마이크로어레이 혼성화로부터의 QC 보고서. A +는 칩의 모든 모서리에서 그리드에서 감지된 신호를 나타냅니다. 히스토그램은 배경 빼기 후 로그백으로 신호 강도 (형광)에 따라 분류 된 신호의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 혼성화 및 스캐닝 후 품질 관리(QC)의 요약. 하이브리드 슬라이드의 값은 열 2(값)에 지정되고 허용 가능한 값의 범위는 열 4에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 세척 챔버 어셈블리의 제조.

표 2: 세척 챔버 어셈블리에 대한 인큐베이션 온도 및 시간.

저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.