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방법 논문

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60617

⸱

2020년 2월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.

초록

Leishmania 종은 leishmaniases, 내장 병변에 절단에서 임상 표현의 넓은 스펙트럼을 제시하는 질병을 일으키는 원인이 되는 원생 동물 기생충입니다. 현재, 1,200만 명의 사람들이 전 세계적으로 Leishmania에 감염되고 10억 명 이상이 감염의 위험에 살고 있는 것으로 추정됩니다. 리슈마니아 아마존은 중남미에서 발병하며 일반적으로 동물 모델에서 직접 시각화 할 수있는 질병의 절단 형태로 이어집니다. 따라서, L. amazonensis 균주는 또한 쉽게 시험관내에서 재배되기 때문에 종족 리슈만편모충증 연구를 위한 좋은 모델이다. C57BL/6 마우스는 인간에서 관찰된 L. amazonensis-구동질병 진행을 모방하고 절단 성 리슈만편모충증을 위한 제일 마우스 긴장 모형의 한개로 여겨집니다. 척추 동물 숙주에서, 이 기생충은 이 세포의 방어 기계장치에도 불구하고 대식세포에 서식합니다. 몇몇 연구 결과는 다른 조건의 기생충 감염을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 반응을 이용합니다. 그러나, 시험관내 접근법은 유기체의 반응을 무시하는 단리된 세포 시스템으로 제한된다. 여기서, 우리는 숙주-기생충 상호작용의 전신 생리학적 개요를 제공하는 생체 내 뮤린 감염 방법을 컴파일한다. L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염을 위한 상세한 프로토콜은 감염성 amastigotes, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 결정으로 기생충 분화를 포함합니다. 우리는 이 잘 확립된 방법을 종피 리슈만편모충증에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구를 위한 가장 적절한 방법으로 제안합니다.

서론

리슈마니아제는 개발도상국에서 중요한 과제를 나타내는 세계적으로 널리 퍼진 기생 전염병이며세계보건기구(WHO)에 의해 가장 중요한 소홀히 한 열대성 질병 중 하나로 인정받고있다. 리슈만편모충증은 상처, 점막 및/또는 내장 증상이 특징입니다. 절단 성 리슈만편모충증은 일반적으로 L. amazonensis, L. 멕시코, L. 브라질리아엔시스, L. guyanensis, L. major, L. 트로피카 및 L. aethiopica3에기인합니다. 이 형태의 질병은 종종 보호 세포 면역 반응의 유도로 인해 인간에서 자가 치유됩니다. 그러나, 세포 면역 반응이 실패할 수 있고, 질병은 종족 리슈만편모충증4,5를전파하기 위하여 진행될 수 있다. 리슈마니아 종과 호스트 유전적 배경 중 다양성으로 인해 사용 가능한 백신이 없습니다6,7. 치료 옵션은 또한 현재 사용 가능한 약물의 대부분이 비싸고 독성이 있거나 장기 치료가 필요할 수 있기 때문에 제한됩니다8,9. 게다가, 사용 가능한 치료에 대한 약물 내성의 보고가 있었다10,11.

리슈만편모충증의 원인인 것은 원생동물 기생충 리슈마니아이다. 기생충은 그것의 생활 주기에 있는 2개의 명백한 형태학적인 양식을 제출합니다: promastigotes, 모래파리에서 찾아낸 깃발 모양; 및 아마티고테스, 포유류 숙주 대식세포12,13의기생충 성 액수올에서 발견되는 세포내 형태. 척추동물 숙주들의 대식세포의 방어 기전에도 불구하고 침략, 생존 및 복제하는 Amastigotes의 능력은 많은 연구의 대상이 된다14,15,16,17. 따라서, 몇몇 연구 단은 기생충 감염에 특정 환경 요인의 충격을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 분석, 뿐만 아니라 기생충 및 호스트 유전자를 기술하고 있습니다. 이 분석은 연구를 높은 처리량 형식으로 적응하는 능력, 결과를 얻기 위해 비교적 짧은 기간, 및 희생된 실험실 동물의 감소수(18)와같은 몇 가지 장점을 제시한다. 그러나, 시험관내 시험관내 비고법의 발견은 항상 생체내 연구에서 복제되지 않기 때문에 제한적이다14,19,20,21. 생체 외 에서 시험관 내 애시스에 의해 완전히 모방 될 수 없는 호스트 기생충 상호 작용의 조직 생리적 개요를 제공 합니다. 예를 들어, 면역학적 연구는 수집된 풋패드 조직 섹션으로부터의 면역조직화학 분석또는 회복된 면역세포의 분석을 위한 포물성 림프절로부터의 면역조직화학분석(22)을 통해 수행될 수 있다.

동물은 종종 질병의 근본적인 생리적 기전을 더 잘 이해하기 위해 생물학적 및 생물의학 연구에서 인간 질병에 대한 모델로사용된다(23). 리슈만편모충증의 경우, 접종의 경로, 부위 또는 투여량이 질병 결과24,25,26,27에영향을 미친다. 더욱이, 인간과 마우스의 감염에 대한 감수성과 저항성은 숙주 및 기생충4,5,22,28,29,30,31의유전적 배경에 의해 매우 조절된다. BALB/c 마우스는 L. amazonensis 절단 감염에 매우 민감하며, 림프절, 비장 및 간32에기생충의 보급과 함께 급속한 질병 진행을 나타낸다. 질병이 절단 전이에 점진할 수 있기 때문에, 감염은 치명적일 수 있습니다. 대조적으로, C57BL/6 마우스는 L. amazonensis 감염 asays33에있는 지속적인 기생충 부전을 가진 만성 병변을 수시로 개발합니다. 이에 따라, L. amazonensis 감염은 BALB/c 마우스 감염 모델5,34보다질병 진행을 더 잘 모방하기 때문에 인간에서 만성 형태의 종족 리슈만편모충증을 연구하는 훌륭한 모델로 간주되고 있다.

따라서, 우리는 생체 내 뮤린 감염이 인간 질병에 적용 가능한 리슈마니아 바이러스 성 생리학적 연구에 유용한 방법이며, 숙주 기생충 상호 작용의 전신 보기를 허용하는 것을 제안한다. 잘 확립된분석22를다시 방문하면, 우리는 여기에 암기생충 분화를 포함하는 L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염의 컴파일된 단계별 프로토콜을 제시하고, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 측정. 이 프로토콜은 다른 마우스 균주 및 리슈마니아 종에 적응될 수 있으며 이는 종족의 리슈만편모충증을 유발한다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 새로운 항리슈마니아 약물 표적 및 백신을 식별하는 데 중요하며, 리슈마니아 감염에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구에서도 중요하다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 상파울루 대학 생명 과학 연구소의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며(CEUA 342/2019), 상파울루 주의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 권장 사항 및 정책에 따라 수행되었습니다(Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) 및 브라질 정부 (레이 연방 11.794, 드 08/10/2008). 섹션 1-5에 설명된 모든 단계는 층류 캐비닛 내부에 무균 적으로 수행되어야한다. 살아있는 리슈마니아 기생충을 처리하는 동안 개인 보호 장비를 활용해야합니다.

1. A. 아마조넨시스 프롬스티고테스를 악센 아마스티고테스15,20,35,36,37,38로 분화

참고: L. 아마조넨시스(MHOM/BR/1973/M2269)(La)기생충이 이 분석에 사용되었다. 연구 목적에 따라, 감염성 기생충 형태는 앞서 설명한바와같이 밀도 구배를 사용하여 전이형 형태의 정제에 의해 또는 다음 프로토콜에 따라 무도회가 축아제내로 분화함으로써 얻어질 수 있다.

  1. 25 cm2 세포 배양 플라스크에서 10 mL의 무도회(pro-medium)(pH=7.0)를 함유하는 라 프로마스티고테스를 성장시다.
  2. 3일 동안 25°C에서 배양합니다.
    참고 : 기생충39,40,41,42,43,44의독성 및 이수성 변화의 손실을 피하기 위해 시험관 내에서 10 배 미만으로 통과 된 promastigote 배양을 사용하십시오.
  3. 피펫 5 mL의 로그 성장 단계 promastigote 배양 새로운 25 cm2 플라스크.
  4. 축산 아마스티고트(아마-미디엄)에 대해 5 mL의 배지를 추가합니다(pH = 5.2).
  5. 34°C에서 3-4일 동안 배양합니다.
  6. 1:3의 비율로 아마 배지로 희석하여 새로운 25 cm2 플라스크로 배양을 분할합니다.
  7. 34°C에서 3-5일 동안 배양합니다.
    참고 : 그것은 성숙의 끝을 나타내는 대로 최대 5 일 동안 축 산 아마스티고를 인큐베이션37.

2. L. 아마존시스와 C57BL / 6 풋 패드 감염

참고: 여성 C57BL/6 마우스 (6-8 주 오래 된) 입수 하 고 상파울루 대학의 생물 의학 연구소의 동물 센터에서 유지. 동물은 음식과 물 광고 리비툼을 받았다.

  1. PBS에서 희석된 기생충 현탁액의 알리쿼트(즉, 혈세포계)로 옮겨 악센 아마티고트의 배양을 계산한다. amastigotes 양식을 나타내는 비 깃발 기생충을 계산합니다.
    참고: 또는, 트라이판 블루 (1:1) 실행 가능한 amastigotes의 수를 계산 하는 데 사용할 수 있습니다 (즉, 그 Trypan 블루로 염색 하지).
  2. 원하는 접종 용량 및 의도 된 접종수의 수에 따라 PBS에서 축 아마스티고를 희석하십시오 (PBS의 50 μL에서 1 x 106 축 아마스티고트 권장).
  3. 준비된 기생충 현탁액으로 27 G 바늘로 결핵 주사기를 적재하십시오.
  4. 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회45에의해 권장대로 3-5 % 이소플루란을 사용하여 C57BL / 6 마우스를 마취 . 발가락 핀치에 대한 마우스의 반응을 테스트하여 마취 깊이를 평가합니다.
  5. 왼쪽 뒷발패드의 아차플란타르 조직에서 균질화된 기생충 현탁액(1 x 106 액센시닉 아마스티고트 또는 원하는 접종 용량)의 50 μL을 접종하고, 이전에 로드된 결핵 주사기를 사용하였다(단계 2.3).

3. 마우스 풋 패드 병변 개발

  1. 캘리퍼스를 사용하여 왼쪽(감염) 및 오른쪽(감염되지 않은) 풋패드의 두께를 측정하여 일주일에 한 번 병변의 진행을 측정합니다.
  2. 병변 진행을 평가하기 위해 매주 왼쪽과 오른쪽 뒷발 사이의 두께 차이를 계산합니다.
  3. X축에 Y축과 감염 시간에 계산된 차이를 플롯하고 통계적 유의를 계산합니다.
    참고: 동물 관리 및 사용 위원회의 권고에 따라, 동물은 피부 궤양이 이차 감염으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 감염된 병변이 궤양이 되기 전에 희생되어야 합니다. 보충 그림 1에도시된 바와 같이, 병변이 이 프로토콜에 사용된 기생충 용량(106 axenic amastigotes) 및 숙주 균주(C57BL/6)와 함께 궤양의 징후를 제시하는 데 약 10주가 걸린다. 마우스는 궤양의 표시가 관찰되기 전에 병변 추출을 위해 희생되어야 합니다.

4. 마우스 풋 패드 병변 추출 및 희석을 제한 하는 기생충

  1. 모든 웰에 180 μL의 프로 배지를 첨가하여 제한적인 희석분석(46,47)을 위한 96웰 플레이트(flat bottom)를 준비한다.
    참고: 각 동물에 대해 4개의 플레이트 레인(플레이트의 절반)을 사용하여 4중계 검정 검정 검정(즉, 동물 1 = 레인 A-D, 동물 2 = 레인 E-H)을 나타냅니다.
  2. 병변 당 유리 조직 분쇄기 튜브에 프로 매체 1 mL을 추가하고 튜브를 무게.
    참고 : 튜브는 멸균 상태로 유지되어야하므로 멸균 뚜껑을 사용하고 라미나 흐름 캐비닛 외부의 무게를 측정할 경우 닫힌 뚜껑으로 튜브를 계량하십시오.
  3. 동물 관리 및 사용 위원회의 권고에 따라 CO2 챔버에서 동물을 희생하십시오. 70% 에탄올로 동물을 소독합니다.
  4. 감염된 풋패드를 추출하고 소독을 위해 풋패드에 70% 에탄올을 분무하기 위해 동물의 발을 발뒤꿈치에 절제하십시오. 가위와 집게의 멸균을 70% 에탄올에 담가 두십시오.
  5. 감염된 풋패드를 멸균 페트리 접시에 놓고 멸균 집게와 메스를 사용하여 해부하여 모든 연조직을 수집합니다. 뼈를 버리십시오.
    참고 : 해부 단계의 균일성은 편향 된 조직 회복을 피하는 것이 좋습니다.
  6. 수집된 조직을 유리 조직 분쇄기 튜브에 프로 배지로 옮은 다음 튜브를 다시 무게를 재하여 병변 무게를 결정합니다.
    참고: 작은 부피가 제거되어 조직 무게가 과소 평가될 수 있으므로 집게와 메스를 매체에 직접 배치하지 마십시오. 병변의 무게는 프로 매체만을 포함하는 관의 무게에서 수집된 조직과 프로 매체를 포함하는 관의 무게를 빼서 계산됩니다.
  7. 완전한 조직 파괴를 위해 분쇄기를 사용하여 조직을 10x 균질화하십시오.
  8. 혼합물을 10 분 동안 침전물을 허용한 다음 상수의 20 μL을 수집합니다.
  9. 4.1단계에서 제조된 96웰 플레이트의1st 레인의 1st컬럼에 상층부체의 20 μL을 적재한다. 다음 세 차선에 대해 각 동물에 대해 4배의 네 배가 되는 경우(즉, 동물 1의 경우 각 웰에 20 μL을 추가하고 A1, B1, C1 및 D1레이블을 지정합니다).
  10. 다중 채널 파이펫을 사용하여 1st 컬럼 10x에서 각각의 웰을 균질화합니다. 이어서, 희석된 시료의 20 μL을1st 컬럼으로부터2nd 컬럼으로 이송한다.
    참고: 각 웰을 한 열에서 다음 열로 10배 균질화하는 것이 중요합니다.
  11. 4.10단계를 마지막 컬럼(12일)까지 나머지모든 컬럼에 반복하고 희석된 시료의 최종 20 μL을 폐기한다.
    참고: 교차 오염을 방지하기 위해 각 희석 후 팁을 변경합니다.
  12. 필름으로 플레이트를 밀봉하고 습한 챔버에서 7 일 동안 25 °C에서 배양하십시오.

5. 병변 기생충 부하 결정

  1. 반전된 현미경을 사용하여 7일간의 배양 후 플레이트를 분석하여 각 차선에 대해 잘 함유된 마지막 기생충을 결정합니다.
    참고: 배지의 색 변화 및 탁도를 시각적으로 분석하여 기생충 또는 세포 밀도의 성장을 나타낼 수도 있다.
  2. 병변 중량당 희석 계수를 나누어 각 레인에 대한 기생충 조직 하중을 계산합니다.
    참고 : 특정 차선에서 기생충이 열 1-5 (즉, 우물 A1-A5는 기생충 성장에 긍정적임)에만 존재하는 경우, 이것은 열 5가 1 개의 기생충만 포함하고, 열 4에는 10 개의 기생충이 포함되어 있음을 의미합니다. 열 1은 상급체의 초기 20 μL에서 기생충의 수를 나타내는 104 개의 기생충을 포함 할 것이다 (단계 4.7에서 비 희석 샘플). 이 20 μL은 프로 배지의 180 μL로 희석되었기 때문에, 초기 튜브에는 5 x 105 기생충이 함유되어 있습니다: (1 x 104)/ (0.02 mL) = 5 x 105 기생충/1 mL. 이어서, 그 병변에서의 기생충 하중은 병변 중량으로 기생충의 초기 농도를 나누어 계산할 수 있다: (5 x 105)/ 병변 중량(단계 4.6 참조).
  3. 로그 Y-스케일을 가진 각 동물에 대한 네 배 의 결과의 평균을 플로팅합니다.

6. 통계분석

  1. 실험군당 적어도 5마리의 동물을 복제하여 평균 ± 표준 편차로 데이터를 나타낸다.
  2. p 값 < 0.05를 유의한 것으로 고려하여 페어링되지 않은 두 꼬리 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.

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결과

Leishmania 원생 동물 기생충은 무척추 동물과 척추 동물 숙주에서 수명 주기 동안 두 가지 발달 형태로 존재합니다 : 무도회, 여성 모래의 내원에서 발견되는 증식 형태; 및 암스티고테스, 포유류 숙주 세포의 기생충 기피액에서 발견되는 증식형태. Promastigotes는 대략 1.5 μm 넓이 및 20 μm 길이의 길쭉한 바디가 있고, 전형적으로 전방 사지에서 나오는 편모와. 아마스티고테스는 길이 2-6 μm, 폭 1.5-3 μm의 크기에 이르는 둥근 또는 난형 체를 가지며, 명백한기모12,13(도 1A)을갖는다. 혈액 식사 도중 무척추 동물 호스트, 가족 Psychodidae의 조혈 곤충은, 리슈마니아 amastigotes에 감염된 대식세포를 ...

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토론

이 프로토콜에 기재된 생체 내 감염 분석법은 모든 연구원이 전신 시나리오에서 숙주 기생충 상호작용을 고려하여 생체 내 종족 근동성 편동증을 평가할 수 있게 한다. 이러한 분석법은 많은 그룹22,24,29,31,32,34,49에 의해 사용되었으며, 여기서 우리는 일부 그룹이 가질 수 있는 인프라 한계를 고려하면서 이 방법을 표준화하기 위한 단계별 프로토콜을 컴파일하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 생체 이미징50,...

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공개 사항

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

상파울루 대학교 생물의학 연구소의 동물 센터의 닐스 올슨 사라이바 카마라 교수님의 지원과 실비아 레니 울리아나 교수님에게 유리 조직 분쇄기를 제공한 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 상파울루 연구 재단에 의해 지원되었다 (FAPESP - MFLS의 보조금 2017/23933-3).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 플레이트Greiner bio-ne655180석 분석을 제한하기 위한 평평한 바닥 플레이트
아데닌SigmaA8626보충제를 M199 세포 배양 배지
캘리퍼에Mitutoyo700-118-20의 두께를 측정하기 위한 캘리퍼
Corning353014리슈마니아 기생충 원심분리기를 배양하기 위한 25 cm2 부피 세포 배양 플라스크
Eppendorf5804R밀도에 따라 시료를 분리하는 데 사용되는 장비
CO2 incubator 34°C; CThermo Scientific3110아마스티고테스 분화를 위한 인큐베이터
에탄올MerckK50237083820일반 품목
소 태아 혈청Gibco12657-029M199 세포 배양 배지에 첨가
보충제 유리 조직 분쇄기 튜브Thomas Scientific3431 E04감염된 발바닥 조직을
수집하고 파괴하는 튜브포도SynthG1008.01.AH보충제가 M199 세포 배양 배지에 추가되었습니다
GraphPad Prism 소프트웨어GraphPad데이터를 플롯하고 통계적 유의성을 계산하는 데 사용되는 소프트웨어
heminSigmaH-2250보충제가 M199 세포 배양 배지에 추가되었습니다
HEPESPromegaH5303보충제가 M199 세포 배양 배지
인큐베이터에 추가되었습니다 25 &데그; CFanem347CDpromastigote 배양 용 인큐베이터
NikonTMSpromastigote 및 amastigote 배양을 육안으로 분석하는 데 사용되는 장비
isoflurane마우스 용 흡입 마취제 (3-5 %)
층류 캐비닛VecoVLFS-09무균 작업 영역
M199 세포에 사용되는 생물 안전 캐비닛 배양 배지Gibco31100-035리슈마니아 배양
마이크로 원심분리기 튜브AxygenMCT150C샘플 수집, 처리 및 보관에 사용되는 마이크로튜브
멀티채널 피펫LabsystemsF61978희석 분석 제한에 사용되는 멀티채널 피펫
NaHCO3Merck6329M199 세포 배양 매체에 첨가
보충제 NaOHSigmaS8045M199 세포 배양 매체에 첨가
보충제 Neubauer 챔버HBG2266기생충 현탁
광학 현미경NikonE200계수하는 데 사용되는 광학 장비
하는 유연하고 내성이 강한 플라스틱 플레이트
페니실린/스트렙토마이신M199 세포 배양 배지에 추가된Gibco15140122
페트리 접시TPP93100발패드 조직을 해부하기 위한 멸균 접시
펫맨 키트GilsonF1673604개의 피펫터(P2, P20, P200, P1000)가 포함된 마이크로피펫 키트,
저울QuimisBG2000수집된 발판의 무게를 측정하는 데 사용되는 장비 병변
메스Solidor10237580026발바닥 조직을 자르고 채취하기 위한 메스
혈청학적 피펫 10 mLNest327001밀리리터 부피를 옮기는 데 사용되는 멸균 피펫
팁Axygen마이크로리터 부피를 옮기는 데 사용되는 피펫 팁
Trypan blueGibco15250-061생존 가능한 기생충을 계수하는 데 사용되는 염료
M199 세포 배양 배지티카제 펩톤Merck
보충제 투베르쿨린 주사기BD305945기생충 현탁액을 접종하기 위한 27G 바늘이 있는 주사기
희 추가 발패드 세포 배양 플라스크용 소독제 된 당 용 세포 배양 배지 된 된 액 기생충 파라필름 Bemis 349를 밀봉 보충제 피에 트립

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