시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 기질 상호 작용은 폐 편평상피암 (LUSC)의 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 그러나, 이러한 동적 상호 작용이 종양 발생 중에 관찰 된 조직 건축 변화에 기여하는 방법을 이해하는 것은 적절한 모델의 부족으로 인해 도전 남아있다. 이 프로토콜에서는 TUM622로 알려진 LUSC 1차 세포 배양을 사용하여 3D 공동배양 모델의 생성을 설명합니다. TUM622 세포는 LUSC 환자 유래 이종이식(PDX)으로부터 확립되었으며 지하 막 매트릭스에서 파종될 때 acinar와 같은 구조를 형성하는 독특한 특성을 갖는다. 우리는 3D 공동 배양에 있는 TUM622 acini가 LUSC 진행 도중 조직 건축의 중요한 특징뿐만 아니라 LUSC 세포와 종양 미세 환경의 분대 (TME) 사이 동적 상호 작용을, 세포 외를 포함하여 재입증합니다 매트릭스 (ECM) 및 암 관련 섬유 아세포 (CAFs). 또한 주요 3D 배양 프로토콜을 적용하여 이 시스템이 다양한 다운스트림 분석에 어떻게 활용될 수 있는지 보여줍니다. 전반적으로,이 organoid 모델은 암진행 동안 상피 아키텍처의 중단을 촉진하고 도움이 될 세포 내재 및 외인성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수있는 생물학적으로 풍부하고 적응 가능한 플랫폼을 만듭니다. 새로운 치료 표적 및 진단 마커에 대한 검색.
서론
폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC), 비 소세포 폐암의 두 번째로 일반적인 유형입니다 (NSCLC) 모든 폐암의 약 30 %를 차지, 종종 고급 단계에서 진단하고 가난한 예후를 가지고1. LUSC 환자를 위한 처리 선택권은 LUSC 종양 발생을 구동하는 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 더 나은 이해에 의해 향상될 수 있는 중요한 충족되지 않은 필요입니다.
대부분의 인간 암과 마찬가지로, LUSC의 병인은 손상되지 않은, 잘 정렬 된 상피 조직 아키텍처의 붕괴를특징으로한다 2. 이 과정에서 적절한 정점 기저 세포 극성, 세포 세포 및 세포 매트릭스 접촉이 손실되어 종양 세포의 통제되지 않은 성장과 침습적 행동을 허용합니다. 암세포와 이들의 국소 종양 미세환경(TME)3사이의 중요한 상호 작용 없이는 암세포의 악성 특징이 나타날 수 없다는 것이 널리 평가되고 있다. 세포외 매트릭스(ECM), 암 관련 섬유아세포(CAFs) 뿐만 아니라 내피 세포및 침투면역세포를 포함하는 TME의 주요 성분은 TME를 능동적으로 형성하고 종양발생을 유도한다
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프로토콜
1. 2D 배양에서 TUM622 셀 및 CA를 통과및 배합
- TUM622 셀의 통과 및 배양
- 37°C에서 TUM622 세포에 대한 따뜻한 3D 배양 배지 및 세포 해리 시약(재료 표참조).
- 2D 플라스크에서 80% 동률에서 통로 TUM622 세포. 보통, 이것은 통과 후 1 주 일어난다.
- T75 플라스크에서 오래된 매체를 버리고 HEPES 버퍼 6 mL로 한 번 씻으십시오. 피펫팅을 세포에 직접 대지 마십시오.
- HEPES 버퍼를 흡인합니다. 트립신/EDTA 4 mL(0.25 mg/mL, 재료 표참조)를 추가하여 빠르게 헹구고 트립신/EDTA를 폐기하십시오.
- 트립신/EDTA 2 mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 트립신에 장기간 노출되면 세포를 돌이킬 수 없게 손상시키고 표현형을 변경하므로 트립신에 노출되는 시간을 제한하는 것이 좋습니다. - 세포가 가벼운 현미경(4x 또는 10x)으로 분리되고 해리된 지 확인합니다. 4mL의 중화 버퍼(TNS 버퍼)를 추가하고(재료 표의하위 배양 시약 정보 참조) 3D 배양 배지의 10mL(재료 표
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결과
2D 문화안의 TUM622 및 CAF
도 1은 2D 배양에서 TUM622 세포 및 CAF의 전형적인 형태를 제시한다. TUM622 세포는 큰 핵으로 반올림되고 CA는 평평하고 길쭉합니다. TUM622 세포는 배양에서 80%-90% 합류에 도달할 수 있습니다. 추가 증식은 더 많은 리드, 하지만 작은 세포 직접 접촉으로 오지 않는 식민지에서 집계. 대조적으로, CA는 더 높은 세포 밀도에서 증가하는 것을 선호하고 충분한 양분이 제공되는 경우에 가득 차있는 confluency에서 증식하는 것을 계속할 것입니다.
3D EC M에서 TUM622 아시니의 성장 및 형태M
도 2는
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토론
종양은 ECM 내의 암 관련 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 기질 세포와 나란히 존재하는 암세포로 구성된 이기종 조직이다. 함께, 이러한 다양한 구성 요소는 교차 이야기와 종양 미세 환경에 영향을, 종양 발생을 구동에 적극적인 역할을, 종양 아키텍처에 있는 점진적인 변화를 수반하는 프로세스. 이상적으로, 종양 발달의 시험관내 모델은 생체 내에서 인간 종양에서 관찰되는 동적 조직 건축 적 변화를 포착할 수 있어야 하며, 종양 미세 환경 내에서 다양한 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 동시에 허용할 수 있어야 한다. 종양 세포와 TME의 구성 요소 모두에 대한 실험 적 조작. 최근 몇 년 동안 3D 암 모델에서 많은 진전이 있었지만, 이러한 모델은 LUSC에 쉽게 나오지 않았습니다. 현재까지 보고된 대부분의 모델에는 이러한 중요한 기능의 몇 가지 측면만 포함됩니다. 여기에서 우리는 LUSC 발달 도중 관찰된 중요한 조직 건축 변경뿐만 아니라 종양 세포와 TME의 주요 분대 사이 동적 상호 작용을 동시에 포착하는 LUSC의.......
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공개 사항
저자는 화이자 의 직원과 주주입니다.
감사의 글
우리는 병리학/조직학 지원을 위한 화이자-종양학 조직 병리학 및 Biomarker 그룹의 Magali Guffroy, 존 Kreeger 및 스테파니 비술코에게 감사하고 원고의 비판적인 검토를 위한 마이클 아렌스만. 우리는 또한 화이자 박사 후 프로그램과 종양학 R & D 그룹, 특히 로버트 아브라함, 푸자 사프라, 카렌 위드빈과 제니퍼 테제다 프로그램의 지원에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 기관지 상피 성장 매체 | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| 세포 여과기 40um | ThermoFisher | 352340 | TUM622 세포 통과용 |
| Cleaved Caspase 3 항체 | 세포 신호 기술 | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | 살생물 | BCS-138 | 3D 배양 |
| CoolSink XT96F | 살생물 | BCS-536 | 3D 배양 |
| Cultrex 3D 세포 수확 키트 | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (공동 배양에 선호) | Bio-Techne | 3443-005-01 | 3D 배양 |
| CXCR4 항체 | Abcam | Ab124824 (RRID : AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin 항체 | BD Biosciences | 610182 (RRID : AB_397581) | 마우스 |
| GelCount | Oxford Optronix | Acini 계수 및 측정용 | |
| GM130 항체 | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | 면역형광용 |
| 열 비활성화 FBS | Gibco | 10082-147 | CAFs |
| 조직학 샘플 젤 | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | 면역형광 |
| 인테그린 알파 6 항체 | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin 항체 | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | 마우스 |
| Ki67 항체 | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II 챔버 #1.5 독일 커버 글라스 시스템 | Nalge Nunc International | 155379 (2) | 3D 문화용 |
| Lab-Tec II 챔버 #1.5 독일 커버 글라스 시스템 | Nalge Nunc International | 155409 (8) | 3D 배양의 |
| 경우 L-글루타민 | Gibco | 25030-081 | CAF의 경우 |
| Matrigel (단일 배양에 선호) | Corning | 356231 | 3D 배양의 |
| 경우 p63 항체 | 세포 신호 전달 기술 | 13109 (SRRID:AB_2637091) | 토끼 |
| 펜/연쇄상 | 구상 구균Gibco | 15140-122 | CAF용 |
| 시약Pack 하위배양 시약 | Lonza | CC-5034 | TUM622 세포 해리용 |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | CAF용 |
| Sox2 항체 | 세포 신호 전달 기술 | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | CAF 해리 |
| Vi-Cell용 | Bechman Coulter | 자동 세포 계수기 | |
| Vimentin 항체 | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin 항체 | 세포 신호 기술 | 2677s (RRID:AB_1030943) | 마우스 |
참고문헌
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Ma....
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재인쇄 및 허가
