Method Article

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

DOI:

10.3791/60647

⸱

January 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단 세포 mRNA 염기서열 분석은 지난 몇 년 동안 중요한 진전을 이루었으며 발달 생물학 분야에서 중요한 도구가 되었습니다. 그것은 성공적으로 희귀 한 세포 집단을 식별 하는 데 사용 되었습니다., 새로운 마커 유전자를 발견, 공간 및 시간 개발 정보를 디코딩. 단일 셀 방법은 또한 지난 2 ~ 3 년 동안 미세 유체 기반 Fluidigm C1 기술에서 액적 기반 솔루션으로 진화했습니다. 여기에서 우리는 액적 기반 scRNA-Seq 방법을 사용하여 마우스 배아 조직 세포를 프로파일업하는 방법을 입증하기 위해 예를 들어 심장을 사용했다. 또한 워크플로우에 두 가지 전략을 통합하여 단일 실험에서 여러 샘플을 프로파일로 프로파일합니다. 통합된 방법 중 하나를 사용하여 8개의 심장 샘플에서 9,000개 이상의 세포를 동시에 프로파일화했습니다. 이 방법은 다른 유전 적 배경, 발달 단계 또는 해부학 적 위치에서 단일 세포를 동시에 프로파일러딩하는 비용 효율적인 방법을 제공함으로써 발달 생물학 분야에 가치가있을 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

각 단하나 세포의 전사 단면도는 배아 발달 도중 세포 인구 사이에서 변화합니다. 단일 분자가 소수의 유전자1의발현을 시각화하는데 사용될 수 있지만, 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)은 단일 세포에서 유전자의 게놈 전체 발현 패턴을 예시하는 편견없는 접근법을 제공한다. 2009년에 처음 발표된 후2,scRNA-Seq는 최근 몇 년 동안다발성발달 단계에서 다중 조직을 연구하기 위해3,4,5. 또한, 인간 세포 아틀라스가 최근 발달 중심 프로젝트를 시작함에 따라 인간 배아 조직에서 더 많은 단일 세포 데이터가 가까운 장래에 생성 될 것으로 예상됩니다.

개발하는 첫번째 기관으로 심혼은 배아 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 심혼은 다중 세포 모형으로 이루어져 있고 각 세포 모형의 발달은 단단히 시간적으로 그리고 공간적으로 통제됩니다. 지난 몇 년 동안, 초기 발달 단계에서 심장 세포의 기원과 세포 혈통은 선천성 심장 질환 병인을 이해하는 데 엄청난 유용한 탐색 도구를 제공하는

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 절차는 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라.

1. 마우스 배아 심장 해부 및 단세포 현탁액 준비

참고: 이 단계는 해부할 배아의 수에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

  1. E18.5 배아 심장을 획득하려면,CO2 투여에 의해 임신한 CD1 마우스를 안락사시한다. 면도기를 사용하여 복부 부위의 원치 않는 모발을 제거하고 70% 에탄올로 피부를 소독하십시오.
  2. 멸균 된 가위를 사용하여 복부의 피부를 자르고 조심스럽게 배아를 해부하고 얼음에 차가운 인산완충 식염수 (PBS)에 신속하게 넣습니다.
  3. 집게와 가위를 사용하여 입체 현미경으로 차가운 PBS로 채워진 10cm 접시에 각 개별 배아에서 조심스럽게 마음을 분리하십시오.
    참고 : 함께 심장으로 폐를 해부하여 네 개의 챔버를 그대로 유지하고 직접 잡기 / 수술 기구와 심장을 당기지 마십시오.
  4. ~ 10cm의 하트를 차가운 PBS로 채워진 새로운 10cm 접시로 옮기고 심장을 왼쪽 심방, 오른쪽 심방, 좌심실 및 우심실로 미세 해부합니다.
    참고: 이것은 각 샘플에서 1 x 106 셀 이상을 산출하는 것....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서, 우리는 다중화 된 단일 세포 mRNA 염기서열 분석이 기관의 별도의 부분에서 다른 샘플을 동시에 처리하기 위해 수행된 방법을 전시하기 위해 예로 마우스 배아 심장을 사용했습니다. E18.5 CD1 마우스 하트는 좌측 심방(LA), 우측 심방(RA), 좌심실(LV) 및 우심실(RV)으로 분리및 해부되었다. 심방 및 심실 세포는 지질 기반 바코드 절차를 사용하여 독립적으로 바코드화하고 GEMs 생성 및 역전사 전에 함께 혼합하였다. 개략적인 개요는 그림 1에나와 있습니다. 라이브러리 시공 전에 cDNA 농도를 정량화했습니다(그림2A). 표준 scRNA-Seq로부터 다중화 scRNA-Seq를 수행하는 구별 중 하나는 내인성 cDNA 라이브러리와 샘플 바코드 cDNA 라이브러리가 cDNA 증폭 및 정제 후 별도로 획득되었다는 것이다(단계 4.2.1 및.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서, 우리는 단일 세포 전사 프로파일을 분석하는 프로토콜을 입증했다. 우리는 또한 scRNA-Seq 워크플로우에서 멀티플렉스 샘플에 두 가지 선택적 방법을 제공했습니다. 두 방법 모두 다양한 실험실에서 실현 가능한 것으로 입증되었으며 비용 효율적이고 배치 효과가없는 단일 세포 실험18,26을실행하는 솔루션을 제공했습니다.

프로토콜을 통과할 때 주의 깊게 따라야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 이상적인 단세포 현탁액은 생존 세포의 >90%가 있어야 하며 세포 밀도는 또한 특정 범위27내에 있어야 한다. 세포 응집체, 파편 및 섬유의 존재를 최소화하기 위해 좋은 품질의 세포를 얻는 것이 중요합니다. 세포 응집체는 샘플 멀티플렉싱에 부정적인 영향을 미치며 액적 생성기계(17)를막을 수 있.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 지질 기반 바코드 시약의 종류 공급과 실험 단계 및 데이터 분석에 대한 제안에 대한 박사 Zev J. Gartner 실험실에서 데이비드 M. 패터슨과 크리스토퍼 S. 맥기니스 에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 설립 되었다 (HL13347202).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x 칩 홀더10x 유전체학120252 330019
10x 크롬 컨트롤러10x 유전체학120223
10x 자기 분리기10x 유전체학120250 230003
10x Vortex 어댑터10x 유전체학330002, 120251
10x Vortex 클립10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation 시스템애질런트G2991AA
애질런트 고감도 DNA 키트애질런트5067-4626피츠버그 대학교 건강 과학 염기서열 분석 코어
바코드 올리고통합 DNA 기술단일 가닥 DNA25 nmol
버퍼 EBQiagen19086
CD1 마우스Chales RiverStrain Code 022주문 임신한 마우스
원심분리기 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073주변 온도에서 보관
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262-20 °에서 보관; C
크롬 단일 세포 3' GEM 키트 v3,4 rxns10x 게놈1000094-20 °에서 저장; C
크롬 단일 세포 3' 라이브러리 키트 v310x 유전체학1000095-20 °에서 저장; C
크롬 단일 세포 3' v3 겔 비즈10x 게놈2000059-80 °에서 보관; C
콜라겐 분해 효소 A시그마 / Millipore101035780014 °에서 분말을 저장; C, -20 °에서 보관; C
콜라겐 분해 효소 B시그마 / 밀리 포어110888070014 °에서 분말을 저장; C, -20 °에서 보관; C 용해 후
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582University of Pittsburgh Health Sciences 염기서열분석 Core
DNA LoBind 튜브 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind 튜브 마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics20000484 °에 저장; C, 비드 클린업 믹스에 사용됨(표 1)
DynaMag-2 자석Theromo Scientific12321D
에탄올, 순수(200프루프, 무수)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL 고선명도 PP 원심분리기 튜브Corning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL 고선명도 PP 원심분리기 튜브Corning Cellgro14-959-49A
태아 소 혈청, 자격, 미국피셔 사이언티픽26140079스토어 -20 ° C
Finnpipette F1 멀티채널 피펫, 10-100μ lTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 멀티채널 피펫, 1-10μ lTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosity 40 μ m, 1000 uL 피펫 팁,
글리세린(글리세롤) 각 50개 팩, 50%(v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Thermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX(Fc 수용체 차단 솔루션)BioLegend4223015 µ 추가; 100 µ에 있는 백만 개의 세포당 인간적인 TruStain FcX의 l; l 염색 부피
이소프로판올 (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239-20 °에서 보관; C, 지질 태그 바코드 라이브러리 믹스에 사용됨(표 1)
지질 바코드 프라이머(Multi-seq Primer)Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Nuclease-Free Water (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR 튜브 0.2 ml 8-튜브 스트립Eppendorf951010022
인산염 완충 식염수(PBS) 칼슘 및 마그네슘 미포함1X Corning Cellgro21-040-CV
인산염 완충 식염수(PBS) 및 10% 소 알부민(Thermo Fisher 제품 대체)Sigma-AldrichSRE0036
피펫 4팩 (0.1– 2.5&뮤; 엘, 0.5-10μ L, 10– 100&뮤; L, 100– 1,000μ L 가변 부피 피펫Fisher Scientific05-403-151
선택 시약(SPRIselect 시약 키트)Beckman CoulterB23318 (60ml)
템플릿 스위치 Oligo10x Genomics3000228-20°C에 보관; C, Master Mix에 사용됨(표 1)
항체 기반 바코드 전략은 Cell Hashing
. 셀 브라우저는 Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics 입니다. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
8.1단계에서 상용 분석 파이라인은 Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ 최신/what-is-cell-ranger
지질 기반 바코드 전략은 MULTI-seq
. 잘 관리된 R 플랫폼은 Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL 초저 보유 필터 피펫 팁USA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL 초저보유 필터 피펫 팁USA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul 초저보유 필터 피펫 팁USA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 안티-마우스 해시태그 1 항체BioLegend1558010.1 - 1.0 µ 100 µ에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포마다 염색 완충액의 l
TotalSeq-A0302 안티 마우스 해시태그 2 항체BioLegend1558030.1 - 1.0 &마이크로; 100 µ에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포당 염색 완충액의 l
TotalSeq-A0302 안티 마우스 해시태그 3 항체BioLegend1558050.1 - 1.0 &마이크로; 100 µ에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포당 염색 완충액
l TrueSeq RPI 프라이머Integrated DNA Technologies단일 가닥 DNA100 nmol, 지질 태그 바코드 라이브러리 믹스에 사용됨(표 1)
Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드Fisher Scientific25200-056
Universal I5Integrated DNA Technologies단일 가닥 DNA100 nmol
이라고도 합니다라고도 합니다입니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell mRNA SequencingMultiplexed scRNA SeqMouse Embryonic CellsDroplet Based MethodHeart Tissue ProfilingCellular Heterogeneity AnalysisGene Ontology PathwayCell Type AnnotationAnatomical Zone ComparisonBarcoded cDNA Library

Related Articles