비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구

요약

우리는 부인과 및 비뇨기과 암 세포주 및 환자 유래 종양의 이식에 대한 대안, 이식 가능한 생체 내 모델로 닭 융모알구암 막 모델을 제시합니다.

초록

마우스 모델은 생체 내 암 연구에 대한 벤치 마크 테스트입니다. 그러나, 비용, 시간 및 윤리적고려는 생체내 암 모형에 있는 대안을 요구하기 위하여 지도했습니다. 닭 융모난토암 막 (CAM) 모형은 종양 발달의 직접적인 가시화를 허용하고 생체 내 화상 진찰을 위해 적당한 저렴하고, 급속한 대안을 제공합니다. 이와 같이, 우리는 부인과 및 비뇨기과 종양을 이 모형으로 접착하기 위한 최적화된 프로토콜을 개발하기 위하여 노력했습니다, 우리는 여기에서 제출합니다. 약 7 일 후, 공기 세포는 껍질에 개구부가 생성되는 계란의 혈관 측으로 이동됩니다. 뮤린과 인간 세포주 및 1 차적인 조직에서 종양은 그 때 이식될 수 있습니다. 이들은 일반적으로 세포 분산을 피하고 세포가 혈관 공급을 모집 할 때까지 영양 지원을 제공하기 위해 세포 외 매트릭스와 매체의 혼합물에서 시드됩니다. 종양은 그 때 계란 부화하기 전에 추가 14 일까지 증가할 수 있습니다. 반딧불이 루시퍼라제로 안정적으로 변형된 세포를 이식함으로써, 생물 발광 이미징은 배아 전체에 퍼진 막 및 암세포에서 종양 성장의 민감한 검출에 사용될 수 있다. 이 모델은 잠재적으로 종양성, 침략, 전이 및 치료 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 치킨 CAM 모델은 기존 뮤린 모델에 비해 훨씬 적은 시간과 재정적 자원을 필요로합니다. 계란은 면역 손상 및 면역 내성 때문에, 어떤 유기체에서 조직은 잠재적으로 인간 조직의 이식에 필요한 비용이 많이 드는 형질 전환 동물없이 이식 될 수있다 (예를 들어, 마우스). 그러나, 이 모형의 많은 이점은 잠재적으로 또한 짧은 종양 생성 시간 및 면역 타협/면역 관용 상태를 포함하여 제한일 수 있었습니다. 추가적으로, 닭 chorioallantoic 막 모형에 여기에서 제출된 모든 종양 모형이 있더라도, 종양 성장의 다양한 각도로 이렇게 합니다.

서론

마우스는 악성종양을 포함한 인간 질병의 연구를 위한 고전적인 모델 유기체로서 사용되어 왔습니다. 포유류로서, 그들은 인간과 많은 유사점을 공유합니다. 그들의 높은 수준의 유전 적 유사성은 인간 질병의 유전 적 통제에 대한 엄청난 통찰력을 제공하기 위해 마우스 게놈의 형질 전환 조작을^{허용했습니다 1.} 마우스를 취급하고 실험에 있는 광대한 경험은 생물 의학 연구를 위한 선택의 모형 귀착되었습니다. 그러나, 뮤린 모델에 관한 윤리적, 과학적 우려 뿐만 아니라, 그들은 또한 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다^2,3. 종양의 발달은 몇 주 또는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 종양이 발전하는 동안 일반적인 기관의 주택만으로도 수백에서 수천 달러의 주택이 운영될 수 있습니다. 난소암은 뮤린 모델에서의 성장이 수개월이 걸릴 수 있기 때문에 이러한 단점의 예입니다. 연구 진행에 있는 지연은 잠재적으로 난소암 환자에 영향을 미칠 수 있습니다' 지속적으로 낮은 5 년 생존율만 47%(즉,30 년 동안 단지 10%의 생존율증가)4. 유사하게, 비뇨기과 암 (신장, 전립선 및 방광암)는 미국에 있는 모든 암 케이스의 19%를 구성하고 암 관련^죽음의11%를 4. 따라서, 부인과 및 비뇨기과 암을 연구하는 생체 내 새로운 접근법은 이 모형이 초기 선별 실험에만 적용되더라도 실험실상당한 시간, 노동 및 돈을 절약할 수 있었습니다. 추가적으로, 연구 사실 인정의 결과적인 가속은 이 암으로 매년 진단된 177,000명의 개별에 현저하게 영향을 미칠 수 있었습니다.

치킨 CAM 모델은 앞서 언급 한 문제를 해결하는 많은 장점을 제공합니다. 혈관 신생을 연구하는 인기있는 모델^5,6,종양 세포 침공^7,8,및 전이^7,9,병아리 배아 CAM 모델은 이미 신경교종^10,11,12,두경부 편평 세포 암^13,14,백혈병^15,16,췌장 암^17,췌장 암 등 다양한 형태의 암을 연구하는 데 사용되었습니다. 대장암¹⁸. 또한, CAM 모델은 신경아세포종^19,버킷림프종^20,흑색종^21,및 펠린 섬유육종^22에대해 생성되었다. 선행 연구는 또한 방광암^(23)과 전립선암 세포주^24의생착을 제시했습니다, 그러나 한정된 프로토콜 세부사항. 뿐만 아니라 계란은 쥐 보다 훨씬 저렴, 하지만 그들은 또한 매우 재현 가능한 결과 생산^25,26. 그(것)들은 빠른 혈관 발달을 보여주고, 종양 생착은 며칠로 빨리 생기고 열린 창을 통해서 세로로 구상될 수 있습니다. 난자 수정과 부화 사이의 21 일 기간으로 몇 주 이내에 실험을 완료 할 수 있습니다. 또한, 저렴한 비용, 제한된 주택 요구, 작은 크기는 마우스 연구에 대한 금지 될 대규모 실험을 쉽게 허용.

따라서, 우리는 부인과 및 비뇨기과 암의 생착에 대한 CAM 모델을 최적화하기 위해 노력했다. 초기 닭^{배아(27)의}면역 손상 상태로 인해, 마우스 및 인간 세포 모두 쉽게 이식될 수 있다. 이와 같이, 우리는 성공적으로 난소, 신장, 전립선 및 방광암을 이식했습니다. 이러한 종양 유형의 각각에 대 한, CAM 쉽게 설립 된 뮤린 및 인간 종양 세포 주를 받아들입니다. 중요 한 것은, 갓 수확 기본 인간의 종양 조직 또한 성공의 높은 속도 소화 된 세포 또는 고체 조직의 조각에서 생착 수 있습니다. 이 암 모형 및 세포 근원의 각각은 우리가 여기에서 공유하는 최적화를 요구합니다.

프로토콜

본 명세서에 제시된 모든 실험은 캘리포니아 대학교, 로스앤젤레스(UCLA)의 적절한 윤리위원회에 의해 검토및 승인되었습니다. 비식별, 원발성 인간 종양의 사용은 UCLA 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다 (의정서 번호 17-000037, 17-001169, 및 11-001363). UCLA에서, 동물 연구위원회 검토닭 배아를 사용 하 여 실험에 대 한 필요 하지 않습니다.; 프로토콜 승인은 계란이 부화 될 때만 필요합니다. 그러나 동물 안락사에 대한 AVMA 지침과 같은 모범 사례는 닭 배아를 윤리적으로 처리하고 가능한 한 통증을 피하기 위해 사용되었습니다. 연구원은 CAM 모델을 사용하여 연구를 시작되기 전에 기관의 감독 요구 사항을 검증할 것을 촉구합니다.

1. 계란 준비

1. 계란을 받기 전에 계란 인큐베이터를 37.8 °C (100 °F)로 조립하고 평형화하고 제조업체의 지시에 따라 60-70 % 습도를 사용합니다.
   참고: 오염 위험을 최소화하기 위해 오토클레이브 워터를 사용하여 습도를 조절할 수 있습니다.
2. 수정을 받은 로드아일랜드 레드 치킨 계란은 공인 된 실험실 급 계란 공급 업체에서 종이 타월로 껍질 표면을 닦아 냅니다. 가볍게 감쇠된 종이 타월을 사용하여 부착된 물질을 제거할 수 있습니다. 즉시 말리십시오.
   참고: 껍질을 43.3 °C 이하의 액체로 적시면 박테리아가 계란에 유입될 수 있습니다. 계란을 씻거나 소독하기로 결정한 경우 액체의 온도는 43.3-48.9 °C 사이여야 합니다. 온도가 높을수록 계란을 끓일 수 있습니다. 소독제의 선택은 우려를 일으키는 미생물에 기초하여 이루어져야합니다.
3. 연필이나 마커를 사용하여 달걀의 날짜에 레이블을 지정합니다. 이는 개발 일 0으로 간주됩니다.
4. 계란을 계란 인큐베이터에 넣고 CAM 개발을 허용하기 위해 회전하여 적어도 7 일 동안 배양하십시오. 자동 회전자를 사용하거나 계란을 하루에 180° 2-3배 회전시킬 수 있습니다.

2. 계란 열기

참고 : CAM이 완전히 개발 된 경우 계란의 개방을 수행해야합니다. 이것은 일반적으로 개발 일 7 또는 8에.

1. 70% 에탄올로 생물 안전 성 캐비닛을 소독하십시오. 마찬가지로 소독하고 바이오 안전 캐비닛에 계란 랙, 계란 촛불, 마커, 실리콘 카바이드 연삭 돌과 원형 절단 휠 무선 회전 도구, 18G 바늘, 쿼터 인치 진공 튜브, 포장 테이프, 사무실 파이펫 컨트롤러 가위, 곡선 가위, 셈켄 (또는 유사한) 집게, 면공, 6 x 7cm 투명 필름 드레싱. 가능하면 멸균, 일회용 또는 오토클레이브 공구를 사용하십시오.
2. 달걀 회전자를 끕니다. 약 1-3개의 달걀을 계란 선반의 생물 안전 성 캐비닛에 넣습니다. 어둠 속에서, 공기 세포를 식별하기 위해 계란 껍질에 계란 촛불을 배치합니다. 에어 셀의 위치를 표시합니다.
   참고 : 계란 촛불에서 조명의 강도는 계란의 내부를 시각화하는 데 중요합니다. 공기 전지 또는 혈관 구조가 일관되게 보기 어려운 경우 계란 캔들 배터리를 교체해 보십시오.
3. 큰 혈관 네트워크를 찾기 위해 껍질 위에 계란 촛불을 이동합니다. 필요한 경우 계란을 돌이십시오. 이상적인 혈관 구조는 계란의 중간 근처에 분기될 것입니다. 마커를 사용하여 이식에 사용할 혈관 위에 그립니다.
4. 후드의 조명을 켭니다. 실리콘 카바이드 연삭 스톤이 장착된 무선 회전 공구를 사용하여 공기 셀의 중앙에 직접 쉘에 작은 구멍을 뚫습니다. 껍질의 대부분이 제거 될 때까지 드릴, 하지만 흰색, 내부 멤브레인은 그대로.
   참고: 혈관을 표적으로 하기 전에 공기 세포를 통해 드릴링하면 CAM 및 혈관 구조보다는 공기 세포 위에 특정 달걀 껍질의 두께를 결정할 수 있습니다. CAM 또는 혈관 구조가 중단되면 계란은 이식에 사용할 수 없습니다.
5. 공기 세포에 대해 수행된 것처럼 혈관 창이 열리는 또 다른 작은 구멍을 드릴링하고 엽니다(단계 2.4).
6. 18G 바늘을 사용하여 공기 세포와 혈관 에 흰색, 내부 막을 부드럽게 관통합니다. 쉘을 관통 할 수없는 경우, 조심스럽게 조금 더 드릴. 드릴 영역 전체에 걸쳐 흰색, 내부 멤브레인(CAM제외)이 중단되었는지 확인합니다. 멤브레인 조각을 제거 할 필요가 없습니다.
   참고: 이 단계에서 CAM 또는 혈관구조가 중단되면 계란을 버리십시오. 구멍에서 혈액이나 알부민이 새는 경우 손상이 분명합니다.
7. 후드 라이트를 끕니다. 계란 촛불을 사용하여 공기 세포가 계란의 끝에서 혈관 을 통해 영역으로 옮겨졌는지 확인하십시오. 필요한 경우, 원래 공기 셀 위에 구멍 주위에 파이펫 컨트롤러에 삽입 된 진공 튜브를 배치하고 부드럽게 공기 셀을 이동하는 짧은 버스트에 흡입을 적용합니다.
8. 마커를 사용하여 에어-CAM 경계 내에서 약 0.5cm 의 공기 셀의 새 위치를 윤곽을 잡습니다. 새 에어 셀 위에 포장 테이프를 부착합니다. 필요한 경우 표준 사무실 가위를 사용하여 테이프를 적절한 크기로 다듬습니다.
   참고: 테이프는 쉘을 통한 공기 흐름을 방해할 수 있으며 공기 셀을 완전히 덮는 데 필요한 것보다 커서는 안 됩니다.
9. 새로운 공기 세포가 위를 향하도록 회전하지 않고 따뜻하게 하기 위해 계란을 인큐베이터로 되감습니다. 나머지 계란을 열려면 2.2-2.9 단계를 반복합니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있습니다. CAM 개발의 품질을 확신할 수없는 경우, 소수의 계란은 나머지 계란을 열기 전에 단계 2.16을 통해 진행해야합니다.
10. 바이오 세이프티 캐비닛의 계란 랙에 재배치된 공기 세포가 있는 약 1-3개의 달걀을 놓습니다.
    참고: 개토된 계란에 오염이 발생하지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 항상 생체 안전 캐비닛 내부에 계란을 열고 가능하면 멸균 도구 및 장비를 사용하십시오.
11. 원형 절삭 휠이 장착된 무선 회전 공구를 사용하여 2.8단계에서 그려진 공기 셀 경계 위로 작은 선을 잘라냅니다. CAM 또는 혈관 구조가 중단되지 않도록 실제 air-CAM 경계 내부에 약 0.5cm인지 확인하십시오. 껍질을 완전히 잘라내지만 CAM이나 혈관을 방해할 정도로 깊숙이 침투하지 않도록 주의하십시오.
12. 구부러진 가위를 사용하여 나머지 공기 셀 주위를 잘라 껍질에 창을 만듭니다.
    참고 : 제거 된 껍질에 혈액이나 막이 있으면 계란이 이식에 적합하지 않습니다. 계란의 높은 비율이 깨끗하게 열리지 않는 경우, 더 나은 CAM 형성을 허용하기 위해 나머지 계란을 열기 위해 적어도 1 일을 더 기다리는 것이 좋습니다. 나머지 계란의 껍질이 관통되지 않은 경우 인큐베이터 내의 계란 의 회전을 재개해야합니다.
13. 배아의 생존 가능성을 확인합니다. 생존 가능한 배아는 광범위한 혈관 구조, 명확한 알부민, 배아 운동 또는 눈에 보이는 심장 박동을 표시합니다.
14. 셈켄 포셉을 사용하여 멸균 면봉에서 작은 면 조각을 당깁니다. CAM 표면을 부드럽게 블롯하여 쉘 먼지와 이물질을 제거합니다.
    참고: 계란이 열리는 날에 잔해를 제거해야 합니다.
15. 6 x 7cm 투명 필름 드레싱의 1 쿼터 조각으로 쉘 오프닝을 덮습니다.
16. 계란을 인큐베이터에 반환합니다. 열린 창이 위를 향하고 CAM이 투명 필름 드레싱에 닿지 않는 가운데 계란이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 계란 선반, 달걀 회전자의 가장자리 또는 다른 적합한 항목을 사용하여 계속 구르는 계란을 소품으로 사용하십시오.
17. 남은 모든 계란을 열 수 있도록 2.10-2.16 단계를 반복합니다.
    참고 : 계란의 개통은 이식과 같은 날에 완료 할 필요가 없습니다. 적어도 1 일 동안 기다리면 껍질을 열어 생존 가능성이 손상된 계란을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 이식용 암세포 현탁액 준비 (옵션 1)

참고 : 이것은 이상적으로 일 7과 10 사이에 개최되어야 이식 직전에 완료될 것입니다. 이식 날짜에 관한 자세한 내용은 5 단계 또는 6 단계의 시작 부분에 있는 메모를 참조하십시오. 이러한 접근법은 모든 세포주 및 배양신장암 종양 소화를 위해 사용되었다.

1. 얼음에 세포 외 매트릭스 용액을 해동.
2. 기계적 및/또는 효소 소화를 사용하여 이식되는 세포 유형에 적합한 방법을 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
3. 이식에 적합한 배지에 이식할 총 세포 수를 다시 중단합니다. 계란 당 1-2 x 10⁶ 세포의 임플란트는 전형적입니다.
   참고: 세포주의 이식에 사용되는 배지는 전형적으로 FBS 또는 혈청 치수를 포함하는 세포를 배양하는 데 사용되는 완전한 배지이다. 종양 소화의 이식은 전형적으로 동일한 암 모형의 세포주를 배양하기 위해 이용된 완전한 매체를 이용한다. 그러나, 필요에 따라 실험적으로 배지 제형에 대한 조정이 이루어질 수 있다. 종양 발달및 성장에 대한 효력은 경험적으로 결정될 필요가 있을 것입니다.
4. 사용되는 세포에 적합한 원심분리기 속도 및 시간을 사용하여 세포를 펠렛한다. 일반적인 속도는 250-300 x g이며시간은 5-10 분입니다.
5. 피펫팅하여 펠릿 된 세포에서 상류자를 제거하십시오. 플릭 또는 파이펫팅을 통해 잔류 매질의 셀을 기계적으로 재중단합니다. 식히기 위해 얼음 위에 놓습니다. 적절한 크기의 파이펫을 사용하여 셀 및 매체의 부피를 측정합니다.
6. 1-2 x 10⁶ 세포가 2.7-4 mg/mL 단백질의 최종 세포 외 매트릭스 농도로 계란 당 20-100 μL의 부피에 이식되도록 이식 볼륨을 계산합니다. 이 계산에 따라 매체, 원하는 성장 인자 또는 첨가제 및 세포외 매트릭스 솔루션을 추가하십시오. 이식할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
   참고: 3.3 단계와 3.6 단계의 계산을 위해 그룹의 모든 계란에 대한 적절한 부피를 보장하기 위해 적어도 반 반 달걀 임플란트의 추가 부피를 통합해야합니다. 난소암 세포주(즉, SKOV3 및 ID8)의 이식을 위해, 난자 당^106개의 세포를 이식하였다. 신장 세포 암 세포주 RENCA의 이식을 위해, 소화된 1차 인간 신장 세포 암종, 전립선암 세포주(즉, CWR, C4-2 및 MyC-CaP) 및 방광암 세포주(즉, HT-1376 및 T24) 및 2 x 10^{6세포로부터} 유래된 배양세포를 이식하였다.

4. 이식용 종양 조각 준비 (옵션 2)

참고: 이식 직전에 완료해야 하며, 이는 7일에서 10일 사이에 이상적으로 진행되어야 합니다. 이식 날짜에 관한 자세한 내용은 5 단계 또는 6 단계의 시작 부분에 있는 메모를 참조하십시오. 1 차적인 난소 및 방광암은 종양 조각으로 이식되었습니다.

1. 얼음에 세포 외 매트릭스 솔루션을 해동. 원하는 성장 인자 또는 첨가제를 함유한 적절한 배지에서 2.7-4 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석하십시오. 얼음에 보관하십시오.
   참고: 종양 조각의 이식은 전형적으로 동일 암 모형의 세포주를 배양하기 위해 이용된 완전한 매체를 이용합니다. 그러나, 필요에 따라 실험적으로 배지 제형에 대한 조정이 이루어질 수 있다. 종양 생착 및 성장에 미치는 영향은 경험적으로 결정될 필요가 있을 것입니다.
2. 메스 또는 가위를 사용하여 신선한 종양에서 조각을 절제하십시오. 이상적인 크기는 양쪽에 2-5mm 범위입니다. 이식준비가 될 때까지 조직을 배지에 담그십시오.

5. 논스틱 링을 사용한 이식 (옵션 1)

참고: CAM이 완전히 발달된 경우 세포는 개발 7일째부터 이식될 수 있습니다. 이식은 종양 발달 및 원하는 실험을 위한 적당한 시간을 허용하는 부화하기 전에 언제든지 생길 수 있습니다, 그러나 태아의 면역 세포는 10 포스트 fertilization^27의주위에 나타나기 시작한다는 것을 주의하십시오. 종양 성장 속도는 세포 유형에 따라 상당히 다양하며 관심 있는 세포 유형에 대해 경험적으로 결정될 필요가 있다. 난소암 및 전립선암 세포를 논스틱 링 방법을 사용하여 이식하였다. 붙지 않는 링을 사용할 수 없는 경우 파이펫 팁을 비슷한 크기로 절단하여 사용할 수 있습니다.

1. 70% 에탄올을 사용하여 생물 안전 캐비닛및 필요한 모든 도구( 달걀 랙, 곡면 홍채 집게, 논스틱 링(1/4 인치 내경), 유리 교반봉, 적절한 볼륨 파이펫 및 팁, 6 x 7cm 투명 필름 드레싱, 사무실 가위, 마커 또는 연필 등 필요한 모든 도구를 소독하십시오. 가능하면 멸균, 일회용 또는 오토클레이브 공구를 사용해야 합니다.
2. 계란을 생체 안전 성 캐비닛에 계란 랙에 이식합니다. 관리 가능한 수의 계란을 선택합니다. 최대 6개까지 가볼 수 있습니다. 그들과 함께 작업하는 동안 계란이 실질적으로 냉각 되지 않도록.
3. 쉘 조각을 당기지 않도록 가장자리를 열린 창쪽으로 굴려 쉘에서 투명 필름 드레싱을 제거합니다. 계란이 실행 가능하고 건강한지 확인하십시오. 이상적인 계란은 작은 용기가 분기와 열린 영역의 중심에 큰 용기를해야합니다.
4. 구부러진 홍채 집게를 사용하여 멸균된 논스틱 링을 용기 위에 CAM 위에 놓고 이상적으로 분기점 위에 놓습니다. 멸균 유리 교반 막대를 사용하여 CAM을 부드럽게 마모시다.
5. 3.6단계에서 셀 현탁액을 논스틱 링의 중심으로 피펫합니다. 대안적으로, 포셉을 사용하여 4.2단계에서 종양 조각을 논스틱 링의 중심에 놓고 4.1단계에서 생성된 세포외 기질 용액의 20-50 μL로 덮는다.
6. 6 x 7cm 투명 필름 드레싱의 1 쿼터 조각으로 개구부를 밀봉하십시오. 적절한 임플란트 명칭으로 계란에 라벨을 붙입니다.
   참고: 그룹 내에서 계란에 번호를 매기하면 세로 관찰이 용이합니다.
7. 계란을 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 껍질의 개구부가 똑바로 세워지고 계란이 안전한지 확인하십시오.
   참고 : 계란은 회전하지 않고 계란 인큐베이터에 반환 할 수 있습니다. 대안적으로, 높은 이식 후 생존가능성은 50%-80%이어야 하는 습도를 모니터링하기 위해_CO2 비활성화및 습도계를 이용한 37-38°C 세포 인큐베이터를 사용하여 얻을 수 있다.

6. 논스틱 링이 없는 이식(옵션 2)

참고: CAM이 완전히 발달된 경우 세포는 개발 7일째부터 이식될 수 있습니다. 이식은 종양 발달 및 원하는 실험을 위한 적당한 시간을 허용하는 부화하기 전에 언제든지 생길 수 있습니다, 그러나 태아의 면역 세포는 10 포스트 fertilization^27의주위에 나타나기 시작한다는 것을 주의하십시오. 이 방법은 신장 세포 암 세포 및 방광암 세포를 이식하는 데 사용되었다.

1. 70% 에탄올을 사용하여 생체 안전 캐비닛 및 필요한 모든 도구( 적절한 부피 파이펫 및 팁, 멸균 10cm 조직 배양 접시, 달걀 랙, 6 x 7cm 투명 필름 드레싱, 사무실 가위 및 마커)를 소독하십시오.
2. 3.6단계에서 생성된 세포 현탁액의 접종 부피를 적절한 크기의 파이펫 팁(200 μL)으로 흡인한다(200 μL은 전형적이다). 팁의 상단 부분을 잡고 조심스럽게 파이펫 팁을 꺼내고 10cm 조직 배양 접시에 수평으로 놓습니다.
3. 그룹 내의 모든 샘플에 대해 6.2단계를 반복하고 각 그룹에 대해 하나의 접시를 가지고 있습니다.
4. 세포외 매트릭스가 부분적으로 중합될 수 있도록 팁을 37°C 인큐베이터에 15-30분 동안 넣습니다.
5. 15 분 의 배양 후 중합 검사를 시작합니다. 소량의 액체는 일반적으로 접시에 놓을 때 팁에서 누출됩니다. 이러한 액체의 중합은 팁 내의 액체의 중합 정도를 추정하는데 사용될 수 있다.
6. 계란을 생물 안전 성 캐비닛에 계란 랙에 이식할 놓습니다. 관리 가능한 수의 계란을 선택합니다. 최대 6개까지 가볼 수 있습니다. 그들과 함께 작업하는 동안 계란이 실질적으로 냉각 되지 않도록.
7. 열린 창쪽으로 가장자리를 롤링하여 쉘에서 투명 필름 드레싱을 제거합니다. 이렇게 하면 껍질 조각을 당기는 것을 방지할 수 있습니다.
8. 계란이 실행 가능하고 건강한지 확인하십시오. 이상적인 계란은 작은 용기가 분기와 열린 영역의 중심에 큰 용기를해야합니다.
9. 적절한 크기의 파이펫 팁 한 개를 놓습니다. 플런저를 누르고 부분적으로 중합된 셀 현탁액을 넓고 잘 발달된 대형 용기 위에 CAM에 강제로 밀어 내도록 하는 것이 이상적으로는 분기점 위에 있습니다.
10. 6 x 7cm 투명 필름 드레싱의 1 쿼터 조각으로 개구부를 밀봉하십시오.
11. 적절한 임플란트 명칭으로 계란에 라벨을 붙입니다.
    참고: 그룹 내에서 계란에 번호를 매기하면 세로 관찰이 용이합니다.
12. 계란을 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 껍질의 개구부가 똑바로 세워지고 계란이 안전한지 확인하십시오.
    참고 : 계란은 회전하지 않고 전용 계란 인큐베이터로 반환 할 수 있습니다. 대안적으로, 높은 이식 후 생존가능성은 50%-80%이어야 하는 습도를 모니터링하기 위해_CO2 비활성화및 습도계를 이용한 37-38°C 세포 인큐베이터를 사용하여 얻을 수 있다.

7. 반딧불 루시퍼라아제 표시 종양의 생물 발광 화상 진찰

참고: 이식된 세포가 반딧불 루시퍼라제 또는 다른 이미징 인자를 코딩하는 유전자로 안정적으로 변환된 경우, 생성된 종양은 생물 발광 이미징을 사용하여 시각화될 수 있습니다. 형광 화상 진찰은 계란 껍질에서 높은 배경 때문에 온전한 계란에 추천되지 않습니다. 쉘의 개구부가 생존을 크게 감소시키기 때문에 이것은 끝점 분석입니다. 종양은 실험적 필요 및 종양 성장의 속도에 적합한 언제든지 심상화될 수 있다. 그러나 평균적으로 계란은 21 일 후 추론을 부화시다. 따라서 개발 일 18원치 않는 해칭을 피하기 위해 적절 한 끝점입니다.

1. 필요한 경우 계란을 이미징 시설로 운반하십시오. 10cm 티슈 배양 접시에 계란을 테이프. 이를 37.8°C(100°F) 계란 인큐베이터로 되돌려 제거하거나 비활성화한 회전 메커니즘을 갖는다. 습도는 운송 및 이미징에 중요하지 않습니다.
2. 구부러진 홍채 집게를 사용하여 CAM이 알부민과 배아와 플러시될 때까지 CAM을 껍질에서 부드럽게 밀어냅니다. 넓은 기울어진 견본 집게를 사용하여, 종양 시각화를 위해 포탄 개구부를 적당하게 확장하기 위하여 껍질의 조각을 끊습니다.
3. 계란 알부민에 30 mg/mL D-루시페린의 최소 50 μL을 주입합니다. 유사한 부피가 이식된 세포를 함유하는 영역에서 비스틱 링 또는 CAM의 표면상으로 피펫팅될 수 있다. 이것은 이상적인 혈관 공급이 없는 상태에서 최적의 생물 발광을 보장합니다. 8 분 동안 배양하십시오.
4. 20-50 μL의 이소플루란을 알의 알부민에 주입하여 알을 마취시다. 추가로 2 분 동안 배양. 대안적으로, 계란은 2-2.5 % 기화 이소플루란을 포함하는 유도 챔버에 배치 될 수있다. 배아 운동이 중단될 때 적절한 마취 깊이가 얻어진다.
   참고: 더 많은 양의 이소플루란(100 μL)을 사용하여 계란을 안락사시킬 수 있습니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 적절한 설정을 사용하여 계란을 생물 발광 이미징 장치 및 이미지에 넣습니다. 이 연구를 위해, 1 분의 노출 시간을 사용했습니다.
6. 남은 CAM과 배아를 이미지화하려면, 10cm 조직 배양 접시에 계란을 엽니다.
   1. 계란의 중간 근처에 계란의 아래쪽에 양손의 손가락과 껍질 개구부의 양쪽에 엄지 손가락으로 계란을 잡아.
   2. 엄지손가락으로 달걀의 두 반쪽을 부드럽게 떼어내고 손가락으로 달걀을 부드럽게 누릅니다.
   3. 껍질이 CAM과 배아에서 대략 반 분리되면, 10cm 조직 배양 접시 위에 거꾸로 계란을 뒤집습니다.
   4. 쉘을 반으로 분리합니다. CAM이 쉘 안쪽에 달라붙는 경우 손가락을 사용하여 캠을 껍질에서 밀어냅니다.
   5. 원하는 경우 배아를 다른 접시로 뒤집을 수 있습니다.
   6. 필요한 경우, 추가의 이소플루란은 7.4단계에서와 같이 투여될 수 있다.

8. 종양 수확

참고: 종양은 실험적 필요 및 종양 성장의 속도에 적합한 언제든지 수확될 수 있습니다. 그러나 평균적으로 계란은 21 일 후 추론을 부화시다. 따라서 개발 일 18원치 않는 해칭을 피하기 위해 적절 한 끝점입니다.

1. 집게로 종양을 잡습니다. 가위 (봄 홍채 가위가 잘 작동) 또는 메스를 사용하여 CAM에서 종양을 조심스럽게 제거하십시오.
2. 종양이 반딧불 루시퍼라아제 유전자로 변환된 경우, 시각화하기 어려운 종양의 성공적인 제거를 확인하기 위해 재이미징을 수행할 수 있습니다.
   참고: 절제된 종양은 특정 실험에 적합한 임의의 방법에 의해 분석될 수 있다. 종양은 또한 CAM 또는 마우스로 이식될 수 있습니다. 종양 동일을 확인하기 위하여는, 종양은 헤마톡신 및 에오신 또는 면역히스토케미칼 염색으로 고정되고, 파라핀을 내장하고, 검사될 수 있다.

결과

지금까지, 우리는 난소, 신장, 전립선 및 방광암을 위해 성공하기 위하여 이식의 이 방법을 찾아냈습니다. 각각은 융통성이 있을 지도 모르지만, 이식을 위한 특정 조건을 확인하기 위하여 최적화되었습니다. 시험된 종양 모형의, 난소암 성장은 생물 발광 화상 진찰의 도움 없이 훨씬 적게 발음되고 전형적으로 보이지 않았습니다(그림 1). 그러나, CAM의 경직은 이식의 지역에 있는 집게로 느껴질 수 있었습니다. 이것은 생물 발광 화상 진찰의 부재에 있는 가능한 종양 성장을 확인하는 것을 도울 수 있습니다, 그러나 추가 검증은 조직학 또는 다른 적당한 방법을 통해 요구될 것입니다. 우리는 생체 내 다른 모델에서 본 것과 일치하는 형태학을 보여주는 인간 및 뮤린 세포주 모두의 성공적인 생착을 달성했습니다(그림 1A 및 1B).

토론

CAM 모델을 사용하여 종양 확장 및 생착은 생체 내 동물 모델에서 기존 모델보다 더 빠르고 직접적으로 관찰 가능한 종양 성장을 허용합니다. 또한, 특히 면역 손상 마우스의 비용과 비교할 때 장비의 초기 구매가 완료되면 비용이 현저히 낮습니다. 닭 배아의 초기, 면역 손상 상태는 쉽게 인간과 뮤린 조직의 생착을 허용합니다. 이러한 강점에도 불구하고 CAM 모델에는 한계가 있습니다. 장기적인 치료 연구가 보증되는 경우 혜택이 될 수있는 짧은 시간도 해가 될 수 있습니다. CAM 모델의 면역 손상/면역 관용 상태 종양-면역 상호 작용의 연구를 복잡 하 게 수 있습니다. 이러한 연구에 대 한, 관심 있는 면역 세포의 공동 이식 필요할 수 있습니다., 아마도 면역 구획의 보충. 게다가, 우리가 CAM 모형으로 생착을 제시한 모든 종양 모형이 있더라도, 성장의 다양한 각도로 이렇게 합니다. 예를 들면, 신장 세포 암은 급속하게 큰 종양을 형성합니다, 그러나 난소암 종양은 생물 발광 화상 진찰의 도움 없이 구상하기 어렵습니다. 종양 성장 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
-010 테프론(PTFE) 흰색 55 Duro Shore D O-링	O-링 Store	TEF010	세포 파종용 논스틱 링. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	인간 전립선암 세포주.
CWR22Rv1			CWR 세포는 Dr. David Agus (University of Southern California의 Keck Medicine)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	인간 난소 CAM 종양의 면역 조직 화학 분석을 위해 1:100의 희석으로 사용됩니다.
D-Luciferin 반딧불이, 칼륨 소금	Goldbio	LUCK-1G
섬세한 작동 가위; 곡선; 날카롭고 날카로운; 30mm 블레이드 길이; 4-3/4 에. 전체 길이	Roboz Surgical	RS6703	이것은 예로 제공됩니다. 유사한 곡선 가위도 작동합니다.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max 툴 키트	Dremel	8050-N/18	이 키트에는 필요한 모든 도구가 포함되어 있습니다.
수정 닭고기 달걀 (로드 아일랜드 레드 - 브라운, 실험실 등급)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	현지 계란 공급업체는 지역적으로만 배송하므로 식별해야 합니다.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	인간 방광암 세포주.
Hovabator Genesis 1588 디럭스 계란 인큐베이터 콤보 키트	인큐베이터 창고	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	다른 계란 인큐베이터를 사용할 수 있지만 신뢰성을 확인해야 합니다. 이식 후에는 CO2가 비활성화된 세포 배양기를 사용할 수도 있습니다.
ID8			상업적으로 이용할 수 없습니다. PMID: 10753190를 참조하십시오.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	다른 캔들러를 사용할 수 있지만, 이것은 우리가 테스트한 것들 중에서 선호됩니다. 이 캔들러는 앞서 언급한 인큐베이터 키트에 포함되어 있습니다.
아이리스 집게, 10cm, 곡선, 톱니, 0.8mm 팁	World Precision Instrument	15915	이것은 예시로 제공됩니다. 유사한 곡선 겸자도 작동합니다. 이 방법에는 여러 브랜드가 사용되었습니다.
이소플루란	클리퍼 배포	0010250
IVIS Lumina II In Vivo 이미징 시스템	Perkin Elmer
Matrigel 멤브레인 매트릭스 HC; LDEV-Free	Corning	354248	외 기질 용액
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	쥐 전립선암 세포주.
휴대용 Pipet-Aid XP 피펫 컨트롤러	Drummond Scientific	4-000-101	유사한 피펫 컨트롤러가 적절할 것입니다.
PrecisionGlide 피하 주사 바늘	BD	305196	이것은 예시로 제공됩니다. 모든 18G 바늘도 비슷하게 작동합니다.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken 집게	파인 사이언스 도구	11008-13	이것은 예시로 제공됩니다. 유사한 집게나 연구자의 취향에 맞는 다른 스타일이 적절할 것입니다.
SKOV3	ATCC	HTB-77	인간 난소암 세포주.
표본 겸자	전자 현미경 과학	72914	이것은 예로 제공됩니다. 생물 발광 이미징을 위해 껍질을 제거하는 데 사용되는 집게는 길이가 약 12.8cm이고 팁 너비가 3mm입니다.
멸균 면봉	Fisherbrand	22-456-885	이것은 예로 제공됩니다. 멸균 된 면봉으로 충분합니다.
고무 경찰관이 있는 젓는 막대; 지름 5mm, 길이 6	United Scientific Supplies	GRPL06	이것은 예시로 제공됩니다. 유사한 유리 교반 막대도 잘 작동합니다.
T24	ATCC	HTB-4	인간 방광암 세포주.
Tegaderm 투명 드레싱 오리지널 프레임 스타일 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
조직 배양 접시, 10cm 지름	Corning	353803	이것은 예시로 제공됩니다. 이와 유사한 멸균 10cm 접시를 사용할 수 있습니다. 조직 배양 치료는 필요하지 않습니다.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 벽(50피트)	Tygon	AACUN017	이것은 예시로 제공됩니다. 비슷한 크기의 튜브도 작동합니다.