방법 논문

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별

DOI:

10.3791/60652

⸱

2019년 12월 21일

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

이 논문에서

요약

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여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.

초록

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B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 현재 유효한 핵 (t)ide 유사체는 바이러스 복제를 강력하게 억제하지만, 그들은 바이러스 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에서 전사 된 바이러스 성 단백질의 발현에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 높은 바이러스 항원 부하가 이 만성 및 HBV 관련 발암에 역할을 할 수 있기 때문에, HBV 처리의 목표는 바이러스 성 단백질을 근절하는 것입니다. HBV 조절 단백질 X (HBx)는 cccDNA에서 바이러스 전사의 활성화의 결과로 염색체 5/6 (Smc5/6)의 구조적 유지 보수를 저하시키기 위해 숙주 DNA 손상 결합 단백질 1 (DDB1) 단백질에 결합합니다. 여기서, 분할 루시퍼라제 보완 분석 시스템을 사용하여, 우리는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하기 위한 포괄적인 화합물 스크리닝 시스템을 제시한다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 내에서 실시간으로 상호 작용 역학의 쉬운 검출을 가능하게합니다. 이 기술은 HBV 감염의 처리를 위한 새로운 치료제를 발견하는 중요한 분석사가 될 수 있습니다.

서론

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B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이며, 연간 2억 4천만 명이 HBV에 만성 감염되고 간경변및 간세포암(HCC)을 포함한 감염합병증으로인한 90,000명의 사망자가 발생한다. 현재 항-HBV 치료제인 뉴클레오스(t)ide 유사체는 바이러스 역 전사를 충분히 억제하지만, 장기적인 임상 목표인 바이러스 성 단백질의 제거를 거의 달성하지 못한다. 바이러스 성 단백질 제거에 대한 그들의 나쁜 효과는 간세포핵2에서에피솜 바이러스 성 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA) 미니 염색체에서 바이러스 전사에 대한 직접적인 영향의 부족으로 인한 것입니다.

HBV 전사는 HBV 조절 X (HBx) 단백질3에의해 활성화됩니다. 최근 연구에 따르면 HBx는 DDB1-CUL4-ROC1 E3 유비퀴틴 리가제 복합체4,5,6을납치하여 cccDNA에서 HBV 전사를 차단하는 숙주 제한 인자인 염색체 5/6(Smc5/6)의 구조적 유지를 저하시키는 것으로 나타났습니다. 따라서, cccDNA로부터의 바이러스 전사를 촉진하는 중요한 단계는 HBx-DDB1 상호작용으로 생각된다. HBx와 DDB1 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물은 바이러스 전사를 차단할 수 있으며, 실제로 니타옥산화물은 실험실에서 개발된 스크리닝 시스템을 통해 HBx-DDB1 상호작용의 억제제로 확인되었다7.

여기서, 우리는 분할 루시퍼라제 상보적분석7,8을활용하는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하는 데 사용되는 편리한 스크리닝 시스템을 제시한다. 분할 루시퍼라제 서브유닛은 HBx 및 DDB1에 융합되고, HBx-DDB1 상호작용은 소단위를 근접하게 하여 밝은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성합니다. 소단위 간의 상호작용이 가역적이기 때문에, 이 시스템은 HBx-DDB1 단백질을 빠르게 해리시키는 것을 검출할 수있다(도 1). 이 시스템을 사용하여, 큰 화합물 라이브러리는 쉽게 스크리닝될 수 있으며, 이는 HBx-DDB1 상호작용을 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물의 발견을 초래할 수 있다.

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프로토콜

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참고: 분할 루시퍼라아제 분석법의 개략적 표현은 도 1A에나와 있으며, 분석 과정은 도 1B에설명되어 있습니다. 상호작용 역학은 세포 라해없이 실시간으로 측정될 수 있다.

1. 세포 준비

  1. 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 배양된 HEK293T 세포를 10% v/v 태아 소 혈청(FBS),37°C에서 1x 페니실린/스트렙토마이신을 20%O2 및 5%CO2로유지한다.
  2. 시드 5 x 106 세포를 100 mm 접시에 DMEM 10 mL로 넣고 밤새 37°C에서 배양합니다.
  3. 다음 방법에 따라 HBx 및 DDB1의 1 μg를 분할 된 루시퍼라제를 세포내로 일시적으로 트랜스펙트합니다.
    참고: 플라스미드 DNA가 형질감염된 양은 사용되는 형질감염 섭정에 따라 달라질 수 있다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시퍼라제의 최적 위치는 사전에 결정되어야 한다. 이 경우 HBx는 DDB1(SmBit-DDB1)의 N-종점에서 HBx(HBx-LgBit)와 DDB1의 C-종단에서 LgBit에 융합되어 최상의 결과(즉, 가장 밝은 루시퍼라아제 신호)를 제공했습니다. 이 프로세스는 이전에 자세히보고된 7.
    1. DNA 응축 완충액(물자표)에서DNA 플라스미드(SmBit-DDB1)의 DNA 플라스미드 및 1 μg를 발현하는 HBx-LgBit의 1 μg를 총 부피 300 μL로 희석한다.
    2. 인핸서 용액 16μL(재료 표)을넣고 1초 동안 와르싱하여 섞습니다.
    3. 샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다.
    4. 60 μL의 형질감염 시약(재료 표)을샘플에 넣고 10 초 동안 소용돌이치면서 섞습니다.
    5. 샘플을 실온에서 8분 동안 배양합니다.
    6. 배양 동안, 접시로부터 배양 배지를 흡인(단계 1.2에서 제조됨)하고, 인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 세포를 세척한다. 흡인으로 PBS를 제거하고 DMEM 7mL를 추가합니다.
    7. 형질감염 복합체를 포함하는 튜브에 3 mL의 DMEM을 추가합니다. 파이펫팅으로 혼합하고 10cm 접시에 세포에 형질 감염 복합체를 추가합니다.
  4. 세포를 37°C에서 10시간 동안 5%CO2 이하의 인큐베이터에서 배양한다.
  5. 다음 방법에 따라 5 x 104 세포 / 50 μL의 흰색 96 웰 플레이트로 세포를 다시 시드하십시오.
    1. 소비된 세포 배양 배지를 제거하고 5 mL의 PBS로 세포를 세척하였다.
    2. 흡인에 의해 PBS를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL를 추가하고, 세포를 분리하기 위해 5분 동안 37°C에서 배양합니다.
    3. DMEM 4 mL를 추가하고 셀 층의 표면에 여러 번 파이펫팅하여 매체를 분산시고. 셀 현탁액을 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮
    4. 실온에서 5 분 동안 500 x g의 원심 분리전 세포.
    5. 상급을 버리고 PBS의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
    6. 실온에서 5분 동안 500 x g의 세포 현탁액을 원심분리하고 상급을 폐기합니다.
    7. 완충된 세포 배양배지(재료 표)로세포 펠릿을 희석하고 10% FBS를 1.0 x 106 세포/mL의 파종 밀도로 보충하였다.
    8. 피펫 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰 내로 넣고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓는다.
  6. 37°C에서 5%CO2 하에서 10시간 동안 세포를 배양한다.

2. 복합 스크리닝

  1. 배양 동안, 스크리닝화합물(재료 표)과용매(디메틸 설폭사이드[DMSO])를 13.5배 농도로 희석시켰다. 예를 들어, 스톡이 10 mM이고 스크리닝 농도가 10 μM인 경우, 완충된 세포 배양 배지의 73.1 μL에 1 μL의 스톡 용액을 추가한다.
  2. 12.5 μL의 발광 기판(재료표)을각 웰에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    참고: 네거티브 컨트롤로, 플레이트의 양쪽 끝에있는 우물 (즉, 열 1 및 12)에는 발광 기판이 포함되어서는 안됩니다.
  3. 발광계(재료표)를사용하여 기준선 발광을 측정합니다.
  4. 초기 측정 직후, 5 μL의 화합물을 추가하고 각 우물에 2.1 단계에서 희석된 DMSO를 제어합니다.
    참고: 최종 농도는 10 μM입니다.
  5. 발광 값을 30분마다 2시간 동안 측정합니다.
    참고: 접시는 실온에서 어둠 속에서 배양해야합니다.
  6. 기준선 신호에 대한 정규화 후 제어 DMSO 처리와 비교하여 억제 효과를 계산합니다.
    참고: 중복 또는 삼중으로 각 화합물을 선별하면 변동을 줄일 수 있습니다.

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결과

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이 프로토콜을 사용한 다음의 대표적인 결과는 그림 2A, B에나와 있습니다. 신호 대 배경 비율이 80보다 크고 Z'factor9 (고처리량 스크리닝을위한 금 표준 품질 지수)가 0.5보다 높았으며,이 분석 시스템은 높은 처리량 스크리닝에 허용되었음을 나타냅니다. 대조군(DMSO 만)에 비해 >40% 억제로 설정된 임계값으로, 우리는 니타옥사니드를 후보약물7로확인하였다. 이 시스템을 사용하여, 더 나은 후보 약물은 다른, 더 큰 화합물 라이브러리를 선별하여 찾을 수 있습니다.

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토론

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우리는 HBx-DDB1 결합 억제제를 찾기 위해 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 편리한 스크리닝 방법을 개발했습니다. 상호작용 역학은 세포 용해없이 살아있는 세포에서 실시간으로 검출될 수 있다. HBx-DDB1 상호 작용의 억제는 Smc5/6의 복원으로 이어지며, 이는 바이러스 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래한다7. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HBV 치료의 부족을 극복할 수 있습니다.

살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 많은 방법이 유효하더라도, 이 상호 작용을 검토하는 것은 어려운10남아 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 하나의 96 웰 플레이트를 스크리플 짧은 시간이 필요합니다. 더욱이, 높은 Z'점수, 높은 처리량 스크리닝을 위한 금 표준 품질 지수9로스크리닝 품질이 만족하...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 문부과학성의 보조금 지원으로 지원되었으며, 일본 스포츠, 과학 기술, 일본 (#19H03430 및 #17K09405 M.O., 그리고 K.S.에 #19J11829), 혁신적인 분야에 대한 과학 연구를위한 보조금에 의해 (#18H05024 M.O.), 일본 의학 연구 개발 기관에서 간염에 대한 연구 프로그램에 의해, AMED (M.O., #JP19fk021005), 혁신적인 개발 및 B에 대한 신약의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), 암 간염에 대한 새로운 약물의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), AB에 의해 #JP19fk0310102 일본 응용지질학재단과 고바야시 암연구재단(M.O.), GSK 재팬 연구보조금 2018(K.S.) 및 미야카와 기념연구재단(K.S.)의 보조금으로 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포 배양 마이크로플레이트, 96 well, PS, F-BOTTOMGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
Effectene transfection 시약Qiagen301425DNA 응축 완충액, 인핸서 용액 및 형질 주입 시약
FBSNichirei포함
GloMax 96 마이크로플레이트 발광계PromegaE6521
HBx– LgBit 발현 DNA 플라스미드우리 실험실요청 시 이용 가능
세포 HEK293TAmerican Type Culture CollectionCRL-11268
NanoBiT PPI 스타터 시스템PromegaN2015Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021포함 원고에서 "완충 세포 배양 배지"로 설명
PBSTakaraT900
페니실린-스트렙토마이신시그마 AldrichP0781
Screen-Well FDA 승인 약물 라이브러리 V2 버전 1.0Enzo Life SciencesBML-2841여기에 사용된 화합물은 다음과 같습니다: 메퀴놀, 메르캅토푸린 수화물, 메스나, 메스트라놀, 메타프로테레놀 헤미설페이트, 메타라미놀 타르타르산염, 메탁살론, 메타콜린 클로라이드, 메타졸아미드, 메테나민 히푸레이트, 메토카르바몰, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 메스코폴라민 브로마이드, 메푹시미드, 메티클로디아지드, 메틸 아미놀레불리네이트&미드닷; HCl, 메틸에르고노빈 말레산염, 메톨라존, 메티라폰, 멕실레틴&미드닷; HCl, micafungin, miconazole, midodrine· HCl, miglitol, milnacipran· HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril · HCl, 모메타손 푸로에이트, 무피로신, 나돌롤, 나프실린&미드닷; Na, naftifine· HCl, naratriptan· HCl, natamycin, nebivolol · HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline· HCl, olsalazine· Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin 염화물, oxytetracycline · HCl, 팔리페리돈, 팔로노스트론&미드닷; HCl, 파로모마이신 설페이트, 파조파닙&미드도트; HCl, 페메트렉시드 디소듐, 페미로라스트 칼륨, 페니실라민, 페니실린 G 칼륨, 펜타미딘 이세티오네이트, 펜토스타틴, 페린도프릴 에르부민, 퍼메트린, 퍼페나진, 페넬진 설페이트, 페닐에프린, 피토나디온, 피메크로리무스, 피타바스타틴 칼슘, 그리고 포도필록스
SmBit– DDB1 발현 DNA 플라스미드요청 시 당사 실험실이용 가능
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049
175012

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
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  9. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  10. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).
  11. Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
  12. Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
  13. de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115(2014).
  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

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