1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

Francis Migneault; Frédéric Gagnon; Emmanuelle Brochiero; Yves Berthiaume; André Dagenais

doi:10.3791/60654

방법 논문

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

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DOI:

10.3791/60654

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2020년 3월 6일

Francis Migneault¹^,²^,³ , Frédéric Gagnon²^,³ , Emmanuelle Brochiero¹^,³ , Yves Berthiaume²^,³ , André Dagenais²^,³

¹Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), ²Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ³Département de médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.

초록

사후 전사 조절을 연구하는 것은 주어진 메신저 RNA (mRNA)의 변조와 세포 항상성 및 대사에 미치는 영향을 이해하는 데 기본적입니다. 실제로, 전사체 발현의 변동은 번역 효율성과 궁극적으로 전사체의 세포 활성을 수정할 수 있다. 몇몇 실험적인 접근은 이 방법의 몇몇이 사후 전사 변조의 적당한 연구 결과 방지하는 한계가 있더라도 mRNA의 반감기를 조사하기 위하여 개발되었습니다. 프로모터 유도 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 있는 유전자를 발현할 수 있다. 이 방법은 세포 항상성을 방해하지 않고 임의의 실험 조건 하에서 주어진 mRNA의 반감기 추정을 허용한다. 이 방법의 한 가지 주요 단점은 기존의 형질 감염 기술에 매우 저항력이있는 고립 된 1 차 세포에서이 기술의 사용을 제한하는 트랜스 펙트 세포의 필요성입니다. 1 차적인 문화에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 세포 및 분자 생물학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 1 차적인 폐포 세포의 유일한 특성 그리고 표현형은 이 세포에 있는 관심 있는 유전자의 사후 전사 변조를 공부하는 것이 필수적입니다. 따라서, 우리의 목표는 1 차적인 배양에 있는 폐포 상피 세포에 있는 관심있는 mRNAs의 사후 전사 변조를 조사하기 위하여 새로운 공구를 개발하는 것이었습니다. 우리는 1 차적인 폐포 상피 세포로 전사로 통제된 plasmid 발현 시스템을 삽입하기 위하여 빠르고 능률적인 과도 형질 감염 프로토콜을 디자인했습니다. 이 복제 전략은 바이러스 성 에피토프를 사용하여 구문에 태그를 붙이면 내인성 mRNAs의 구성발식을 쉽게 차별할 수 있습니다. 수정된 ΔΔ 정량화 주기(Cq) 방법을 사용하여, 전사체의 발현은 그 반감기를 측정하기 위해 상이한 시간 간격으로 정량화될 수 있다. 우리의 데이터는 1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 각종 병리생리학 조건에 있는 사후 전사 적 조절을 공부에 있는 이 새로운 접근의 효율성을 보여줍니다.

서론

mRNA의 반감기를 결정하기 위하여 몇몇 기술이 개발되었습니다. 표지된 mRNAs를 이용하는 펄스 추적 붕괴 기술은, 최소한의 세포 소요를 가진 mRNAs의 큰 풀의 동시 평가를 허용합니다. 그러나, 이러한 접근법은 단일 유전자 전사체의 반감기에 대한 직접적인 추정을 허용하지 않으며 성장 인자, ROS, alarmins, 또는 염증^1을가진 자극에 따른 mRNA의 사후 전사 변조를 연구하기 위해 구현될 수 없다.

actinomycin D 및 α-amanitin과 같은 전사 억제제의 사용은 시간이 지남에 따라 mRNA 분해 역학을 측정하는 비교적 간단한 방법입니다. 이전 기술에 비해이 방법의 한 가지 주요 장점, (즉, 펄스 추적) 직접 주어진된 성적 증명서의 반감기를 추정 하 고 다른 치료 그것의 저하 역학에 영향을 미칠 수 있는 방법을 비교 하는 능력에 의존. 그러나, 세포 생리학에 대한 전사 억제제의 유의한 해로운 영향은 접근법^2의주요 단점을 나타낸다. 실제로, 이들 약물을 사용하는 전체 세포 전사체의 억제는 마이크로RNA(miRNA)와 같은 mRNA 안정성에 관여하는 주요 원소의 합성을 교란시키는 부정적인 부작용뿐만 아니라 MRNA 결합 단백질의 발현 및....