고형 종양 세포주에서 측면 집단 세포의 비율을 측정하는 편리하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시된다.
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이 논문에서
요약
초록
암 줄기 세포 (CSC)는 종양 성장, 전이 및 재발의 중요한 원인입니다. CSC의 격리 및 식별은 종양 연구에 큰 의미가 있습니다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 및 종양 세포주에서 CSC의 식별 그리고 정화를 위해 이용됩니다. 측면 집단(SP) 세포의 분리 및 분석은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다. 이 방법은 HCs가 Hoechst 33342와 같은 형광 염료를 빠르게 추방하는 능력에 의존합니다. 염료의 efflux는 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송기와 연관되고 ABC 수송 억제제에 의해 억제 될 수있다. Hoechst 33342를 사용하여 배양된 종양 세포를 염색하고 혈류 세포에 의한 SP 세포의 비율을 분석하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 분석에서 생성된 데이터는 종양 세포의 줄기 특성에 대한 유전자 또는 기타 세포 외 및 세포 내 신호의 효과에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.
서론
암 줄기세포(CSC)는 자가 재생 능력과 여러 분화 잠재력을 가진 세포의 하위 집합으로 종양 성장, 전이 및 재발1,2에서중요한 역할을 한다. 현재 CSC는 폐, 뇌, 췌장, 전립선, 유방암 및간암3,4,5,6,7,8,9를포함한 다양한 악성종양에존재하는 것으로 확인되었습니다. 이들 종양에서 CSC의 식별은 주로 CD44, CD24, CD133 및 Sca-19,10의높은 및/또는 낮은 발현과 같은 표면 마커 단백질의 존재에 기초하지만, 비-CSC로부터 CSC를 구별할 수 있는 독특한 마커는 지금까지 보고되지 않았다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 또는 종양 세포주에서 CSCs....
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프로토콜
1. 셀 준비
- 세포 소화 및 중화
- 종자 종양 세포(예: MDA-MB-231 세포)는 6웰 플레이트에서, 5%CO2로공급되는 37°C 인큐베이터에서 배양한다.
- 그들의 밀도가 대략 90%에 도달할 때 세포를 수확합니다. 배양 배지를 철저히 흡인시키고 3mL의 인산염 완충식식염수(PBS)로 세포를 2x 세척한다.
참고: 종양 세포의 줄기 기능에 대한 신호 경로 억제제 (예를 들어, FRA1 억제제), 또는 활성제 (예를 들어, STAT3 활성제)의 효과를 검사하기 위해 종양 세포는 6 웰 플레이트에 시드되고 수확하기 전에 일정 시간 동안 억제제 또는 활성기로 전처리됩니다. - 6웰 플레이트의 각 웰에 0.25%의 500 μL을 추가하고, 플레이트를 37°C에서 37°C에서 1-3분(분)에 넣고 부드럽게 플레이트를 눌러 세포를 분리합니다.
참고: 장기간 소화는 세포 생존가능성의 변화로 인한 SP 프로필에 영향을 미칩니다. - PBS3mL을 6웰 플레이트의 각 웰에 2% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하여 소화를 종료하고 세포를 위아래로 3~5배 씩 부드럽게 피펫하여 세포 덩어리를 분산시다.
- 새로운 6 웰 플레이트의 한 웰에 세포 현탁액의 0.5 mL을 추가하고 현미경....
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결과
이 방법에 따라 4개의 실험SP 분석이 수행되었다. 첫 번째 하나에서, 우리는 정상 조건하에서, 3중 음성 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 있는 SP 세포의 비율을 검출했습니다. 세포 계수 후 Hoechst 33342를 1 x 106 세포를 포함하는 하나의 튜브에 첨가되어 3 μg/mL의 최종 농도를 하였다. 레서핀과 호흐트스트 33342는 각각 40 μM 및 3 μg/mL의 최종 농도에 다른 튜브에 첨가되었다. PI는 두 튜브에 추가되었습니다. FSC-A(X축) 대 PI-A(Y축)의 도트 플롯은 3개의 집단을 나타냈다: 1) 죽은 세포를 나타내는 PI 양성 세포 집단; 2) 세포 파편; 및 3) 주요 인구는 PI-음수 세포였으며, 이는 추가분석(도 1A,B)을받았다. FSC-A(X축)의 도트 플롯에서 게이트된 단일 세포 집단과 FSC-W(Y축) 및 SSC-W(Y축)대 SSC-A(X축)의 도트 플롯(Y축)을 사용하여.......
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토론
SP 분석기의 경우 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫 번째는 각 세포주에 대해 베라파밀 또는 레서핀과 같은 적절한 차단제의 선택이며, SP 세포의 "게이트" 위치는 차단기의 첨가 후 많은 수의 SP 세포가 사라지는 위치에 따라 결정되기 때문이다. MDA-MB-231 세포주, 레서핀은 잘 작동합니다. 그러나, 다른 세포주에 대 한, 다른 차단제 더 나은 작동 수 있습니다.
두 번째는 Hoechst 33342의 농도입니다. 대표적인 데이터가 나타난 바와 같이 Hoechst 33342의 염색 농도가 감소함에 따라 SP 세포의 비율이 증가했습니다. 이러한 현상은 염료 섭취운동학(24)에의해 설명될 수 있다. 염료 농도의 변화는 세포에서 Hoechst 3342의 농축에 영향을 미칩니다. 따라서 Hoechst 33342 염색 농도는 SP 분석결과와 밀접한 관련이 있다. 더욱이, Hoechst 33342의 섭취 및 추방은 세포 모형 사이에서 다릅니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 81572599, 81773124, 81972787 대한 중국 자연과학 재단의 지원을 받았습니다. 천진시 자연과학재단(중국) 19JCYBJC27300; 천진인민병원 & 난카이대학 협력연구보조금 2016rmnk005; 중앙 대학, 난카이 대학 63191153 대한 기본 연구 기금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6 웰 세포 배양 플레이트 | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (대략) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| 소 태아 혈청(FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| 유세포 분석기 소프트웨어 | BD Biosciences | FACSDiva | |
| 유세포 분석 소프트웨어 | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관 | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium 요오드화물 (PI) | 시그마 - 알드리치 | P4170 | 3,8- 디아 미노 -5- [3- (디 에틸 메틸 암모니오) 프로필] -6- 페닐 페난 트리디늄 디 요오드화물 |
| 레저 핀 | 시그마 - 알드리치 | 83580 | (3 β, 16 β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드 | Gibco | 25200072 | |
| 베라파밀 염산염 | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필발레로니트릴 염산염 |
참고문헌
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al.
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