안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

요약

여기서, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 38 발현의 분자 특성화를 제시합니다.

초록

Duchenne 근 이영양증 (DMD)은 근육 질량의 점진적 인 손실을 일으키는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망으로 이어집니다. 돌연변이는 수시로 dystrophin 단백질의 거의 총 부족귀착되는 왜곡된 독서 프레임 및 조기 정지 코돈귀착됩니다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기를 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있다. 모르폴리노 AON viltolarsen (코드 이름: NS-065/NCNP-01)는 엑슨 53 건너뛰기를 유도하여 엑슨 52 삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하는 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 NS-065/NCNP-01의 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 DMD 환자에게 정맥으로 관리했습니다. 이 방법 문서에서는, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 발현의 분자 특성화를 제시합니다. dystrophin 발현의 특성화는 기능성 결과 시험이 수행되지 않았기 때문에 효능을 보여주는 연구에서 기본이었습니다.

서론

두첸 근이영양증(DMD)은 근육량, 호흡부전 및 심근병증의 점진적 손실을 유발하는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망^1을이끈다. 이 질병은 큰 구조 근육 단백질 디스트로핀^2의부족에 의해 발생합니다. X 염색체에 DMD 유전자에 있는 돌연변이는 열적이고, 질병은 3500-5000의 새로운 태어난 남성^3,,4,,5에있는 1에 영향을 미칩니다. 돌연변이는 종종 엑소톤 44와 55 사이의 핫스팟 영역에서 큰 삭제로 인해 왜곡된 판독 프레임과 조기 정지 코돈으로 이어지며, 이는 말도 안되는 매개 부패와 거의 총 결여된 디스트로핀 단백질^6,,7,,8을유발한다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기및 판독 프레임을 복원유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있으며, 부분적으로 디스트로핀 발현을 복원하고 질병 진행을^{지연9,,10,,11.} 최근 연방약국(FDA)의 승인을 받은 모르폴리노 AON eteplirsen은 엑슨 51의 건너뛰기를 유도하고, 엑슨 52절,^,13을가진 환자에서 판독 프레임을 복원할 수 있다.¹² 그러나, 엑슨(53)은 엑슨 52삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하고, 잠재적으로 DMD 환자^14의약 10%를 치료할 수 있다. 모폴리노 AON 약물 NS-065/NCNP-01은 인간 세포에서 엑슨 53 건너뛰기를 유도하는 것으로 나타났다. 그리고 우리는 최근 1상 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험 (이하 "연구"로 지칭) (UMIN으로 등록 된 1 단계 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험에서 DMD 환자에게 NS-065 /NCNP-01을 투여하였다: 000010964 및 ClinicalTrials.gov: NCT02081625)^14. 연구 결과는 서쪽 블로팅에 근거를 둔 RT-PCR 및 dystrophin 단백질 수준에 근거를 둔 엑슨 53 건너뛰기의 복용량 의존적인 증가를 보여주었습니다, 아니 가혹한 불리한 약 사건 또는 중퇴는 관찰되지 않았습니다^14.

모든 임상 시험에서, 결과의 분석은 가장 중요 합니다. DMD 임상 시험에 대 한, 논쟁은 여전히 치료 혜택을 보여주는 최고의 방법에 관한 진행. 6 분 도보 테스트와 같은 임상 테스트에는 특정 단점이 있습니다. dystrophin 발현의 분자 특성화는 RT-PCR, qPCR, 디지털 PCR, 서부 블로팅 및 면역 작용과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 임상 혜택을 부여 하는 데 필요한 단백질 발현 복원의 정도 불분명 남아. 본 방법 문서에서는, AON 건너뛰기 약물 NS-065/NCNP-01^14의1상 시험에서 각각 엑슨 건너뛰기 및 단백질 수준을 결정하는 데 사용되는 RT-PCR 및 서부 블로팅 방법을 자세히 설명한다.

프로토콜

조사자가 시작한 재판에 대한 운영 절차는 NCNP 윤리위원회(승인 ID: A2013-019)에 의해 승인되었습니다.

1. 근육 샘플 준비

참고: 이두근 브라치 또는 사두근 근육은 종종 생검 부위로 선택됩니다. 그러나, 티비아리스 전방은 임상 시험에서 사용되었다.

1. 환자로부터 근육 생검
   1. 피부 준비 전에 절개 부위를 표시합니다.
   2. 생검 표본에 식염수 약화 거즈를 준비합니다. 거즈를 잘 짜내라.
   3. 피부와 피하 조직에 국소 마취를 주입하지만 근육에는 사용하지 않습니다. 상처 통증의 부재에 의해 마취의 깊이를 확인하십시오.
      참고: 전신 마취는 일반적으로 15 세 미만의 소아 환자에서 사용됩니다.
   4. 피하 조직에 피부에서 절개를합니다. 작은 리트랙터를 사용하여 절개를 열고 피하 지방을 분리하십시오.
      참고: 이 단계에서, 피부의 일부가 섬유아세포 배양을 위해 절단될 수 있습니다.
   5. 근막에 또 다른 작은 절개를하고 근막을 더 잘라. 모기 집게를 사용하여 가장자리를 고정하여 근육을 노출시하십시오.
   6. 봉합사를 사용하여 근육의 선택한 부분을 당깁니다. 아이리스 가위를 사용하여 작은 터널을 만들고 터널에 모기 집게를 삽입합니다.
   7. 집게를 사용하여 근육 번들을 분리하고 대상 부분의 양 끝을 잘라냅니다.
      참고: 근육 생검 표본은 성인 환자를 위한 연필의 크기 의 주위에 있어야 합니다 (길이 1.0-1.5 cm, 직경 0.8-1.0 cm). 표본은 소아 환자에서 길이가 약 1cm, 직경 은 5mm여야합니다.
   8. 시편을 식염수-감쇠 거즈로 감싸고 상온(RT)에서 신선한 근육을 즉시 운반하여 시편을 추가 분석을 위해 준비할 수 있는 시설로 이송한다.
      참고: 운송 기간이 1시간을 초과하는 경우 표본은 4°C로 운송해야 합니다.

2. 근육 샘플 준비

1. 잇몸이 부드럽고 끈적거리게 될 때까지 동일한 양의 트라가칸스 껌과 물을 섞습니다. 혼합물을 25mL 주사기에 적재합니다. 주사기는 냉장고에 보관할 수 있습니다.
2. 코르크 디스크에 약 0.5~1cm의 트라가칸스 껌을 놓습니다. 반대쪽에 있는 디스크에 레이블을 지정합니다.
3. 액체의 일부가 정지 될 때까지 액체 질소에 이스펜탄의 용기를 배치합니다.
4. 표본을 트라가칸스 잇몸에 놓습니다. 각 근육의 세로 축은 코르크에 수직이어야한다. 적절한 배치를 돕기 위해 각 근육의 바닥 주위에 잇몸을 배치합니다.
5. 핀셋을 사용하여 근육/코르크 표본을 2.3단계에서 준비하여 동결시 냉장 시편을 차갑게 놓습니다. 시편을 1분 또는 완전히 얼릴 때까지 지속적으로 이동하여 일시적으로 드라이 아이스에 놓습니다.
6. 표본을 유리 바이알에 넣고 -80 °C에 보관하십시오.

3. 근육 단면

1. -25°C의 작동 온도로 단면에 대한 저온을 설정합니다.
2. 코르크 / 근육 블록을 마운트하고 평평한 섹션이 달성 될 때까지 손질.
3. RT-PCR 및 서부 블로팅에 10 μm의 단면 두께를 사용합니다. 각각 면역히스토화학 또는 헤마톡슬린 및 에신 염색에 6-8 μm 및 10-12 μm의 두께를 사용한다. 슬라이스 된 섹션을 2.0 mL 튜브에 넣고 RT-PCR 및 서부 블로팅을 위해 -80 °C에 보관하십시오.

4. RNA 추출 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)

1. 냉동 근육에서 10 μm 두께로 약 10 개의 조각을 냉동 근육으로 추출하십시오. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA의 정제 키트를 사용하여 정제된 총 RNA를 수집합니다.
2. 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.
3. 표 1에따라 PCR 튜브에서 RT-PCR 반응에 필요한 시약을 결합합니다. 프라이머 시퀀스의 표 2를 참조하십시오.
   참고: 전방 프라이머는 환자 NS-03 및 46F 환자 NS-07용 44F였습니다. 역프라이머는 기본값으로 54/55R이었습니다. 비특정 제품이 명백한 경우, 54R은 대안으로 사용되었다.
4. 혼합물을 함유한 PCR 튜브를 열 순환기에 놓습니다. 표 3에따라 열 순환기를 실행합니다.
5. PCR 제품을 4°C에 저장하여 단기 저장또는 장기 보관을 위한 -20°C를 저장합니다.

5. 마이크로 칩 전기 포와 엑슨 건너뛰기 계산

참고: 마이크로칩 전기포고증(MCE) 시스템은 종종 엑슨 건너뛰기 효율을 분석하기 위해 선택됩니다. 이 프로토콜에서는 제조업체 A와 제조업체 B의 MCE 시스템을 사용하여 엑슨 건너뛰기 효율을 분석하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 임상 시험 중, 엑슨 건너뛰기 효율은 시스템 A에서 분석되었다. 그러나 시스템 A는 더 이상 판매되지 않으며 시스템 B를 사용하여 엑슨 건너뛰기 효율을 분석하는 것이 좋습니다. 두 시스템에 대한 프로토콜이 포함되어 있습니다(시스템 A의 경우 섹션 5.1, 시스템 B의 경우 5.2 항 참조). 시스템 A 및 B에 관한 정보는 재료 표를 참조하십시오. 더욱이, 이 단계는 또한 일반적인 아가로즈 젤 전기포고증으로 수행될 수 있지만, 감도는 현저하게 감소한다.

1. 시스템 A를 이용한 마이크로칩 전기전도
   참고: 시스템 A에는 두 가지 유형의 칩이 있습니다. 여기에서 는 DNA 칩의 단계를 설명합니다.
   1. 키트 시약(얼룩 버퍼, 로딩 버퍼, 사다리 및 젤 버퍼)을 RT, 소용돌이 및 스핀 다운에 대고 평형화합니다.
   2. 젤 얼룩 버퍼 (GS)를 준비하려면 10 s에 대한 젤 버퍼와 소용돌이의 250 μL에 얼룩 버퍼12.5 μL을 추가합니다. 15분 동안 2,400 x g에서 스핀 필터 튜브및 원심분리기로 솔루션을 이동합니다. 필터를 삭제합니다.
      참고: 여과된 GS는 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
   3. 샘플이 고농축된 경우 TE 버퍼 또는 DNase가 없는 물로 약 50 ng/μL로 희석하십시오.
      참고: 샘플이 염 농도 ≥ 200 mM KCl(또는 NaCl) 및/또는 15m MgCl_2에있는 경우 완충액을 교환한다.
   4. DNA 칩의 겔 프라이밍(강조 표시 및 레이블이 지정된 GS)에 GS 용액 12μL을 추가하고 칩을 프라이밍 스테이션에 배치합니다.
      참고: 기포를 피하려면 파이펫 팁을 분배할 때 피펫 팁을 수직으로, 그리고 우물 바닥에 삽입합니다. 파이펫의 첫 번째 정류장에 천천히 분배하고 파이펫팅 단계의 끝에서 공기를 배출하지 마십시오.
   5. C3 모드를 선택하고 시작 버튼을 누릅니다. 프라이밍이 완료되면 칩을 제거합니다.
   6. 마이크로 채널을 통해 갇힌 기포 나 불완전한 프라이밍을 시각적으로 검사합니다.
   7. 준비된 샘플과 사다리를 아래와 같이 칩에 적재합니다.
      1. 다른 3 개의 GS 우물에 GS 용액의 파이펫 9 μL.
      2. 파이펫 5 μL의 로딩 버퍼는 L 우물에 있고 각 샘플은 잘 (1-11).
      3. L 우물에 사다리의 파이펫 1 μL.
      4. 11개의 견본 우물의 각각에 DNA 견본의 파이펫 1 μL.
      5. TE 또는 DNase가 없는 물의 파이펫 1 μL이 사용되지 않는 우물에 넣습니다. 키트 빠른 가이드는 칩 레이아웃의 그림을 보여줍니다.
         참고: 가볍게 착색된 배경 위에 칩을 들고 기포를 위해 모든 우물을 검사합니다. 깨끗한 파이펫 팁또는 솔루션을 제거하고 재장전하여 우물 바닥에 갇힌 기포를 제거합니다.
   8. 칩을 소용돌이 스테이션에 놓고 믹스를누릅니다. 소용돌이 역은 1 분 후에 자동으로 중지됩니다.
   9. 적재 후 5분 이내에 전기 전광소 스테이션에서 칩을 실행합니다.
   10. 소프트웨어 도구 모음에서 새 실행을 선택합니다. 새로운 실행 화면에서 분석 풀다운 목록에서 DNA와 DNA 1K를 선택합니다.
   11. 프로젝트 풀다운 목록에서 실행에 대한 프로젝트 폴더를 선택하거나 프로젝트 필드에 이름을 입력하여 새 프로젝트 폴더를 만듭니다.
   12. 접두사 실행 필드에서 실행 이름을 입력하고 실행 시작을 클릭합니다.
   13. 계측기는 분석이 완료되면 경고음이 울리고 실행 끝을 나타내는 창이 열립니다. 확인을 선택하고 칩 플랫폼에서 칩을 제거합니다.
   14. 파일 선택 | 데이터를 내보내 데이터를 내보냅니다. 내보내기 대화에서 원하는 옵션을 선택합니다.
   15. 전극을 청소하려면 800 μL의 탈수로 청소 칩을 채우고 칩 플랫폼에 놓고 뚜껑을 닫고 1 분 동안 닫습니다. 1분 후 뚜껑을 열고 클리닝 칩을 제거하고 전극이 1분 동안 건조되도록 합니다.
2. 시스템 B를 이용한 마이크로칩 전기전도
   1. 운영 소프트웨어를 열고 샘플 정보를 입력합니다. 정보를 입력한 후 소프트웨어는 버퍼 및 마커 솔루션을 자동으로 분리하는 양을 계산합니다.
   2. 소프트웨어에서 계산한 버퍼분리의 필요한 양을 준비합니다. 먼저, 10,000x 용액을 적절한 양의 TE 버퍼로 희석하여 100x 핵산 젤 얼룩용액을 준비한다. 100x 용액은 -20°C에 저장할 수 있다.
   3. 1x 용액을 준비하기 위해 회사에서 제공하는 특정 튜브에 분리 버퍼와 100x 핵산 젤 얼룩의 적당한 양을 혼합한다. 용액을 소용돌이시다.
   4. 튜브에서 필요한 양의 마커 용액을 준비합니다.
   5. 프로브 세척 프로그램을 시작합니다.
   6. 완료되면 마이크로칩 세척 프로그램을 시작합니다.
   7. 동시에 샘플을 PCR 멀티 플레이트(96-well, clear)로 피펫하고 탈온화된 물로 4회 희석합니다. 기계가 처리할 수 있는 최소 부피는 6μL이고 최대량은 30μL입니다. 총 부피 10μL(2.5μL 의 시료 및 물/TE 버퍼 7.5 μL)을 제안합니다.
   8. 접착제 PCR 밀봉 호일 시트로 플레이트를 덮고 샘플을 스핀 다운합니다.
   9. 기계에 의해 표시된 배치에 따라 플레이트, 마커 용액 및 1x 분리 버퍼를 기계에 설정합니다. 시작 버튼을 누를 수 있습니다.
   10. 실행이 완료되면 결과 데이터를 소프트웨어에서 .csv 파일로 내보내고 다음과 같이 어금니 농도를 사용하여 엑슨 건너뛰기 효율을 계산합니다.
       엑슨 건너뛰기 효율 (%) = (건너 뛴 밴드 / (건너 뛴 밴드 + 생략 밴드) X 100

6. 보완 DNA (cDNA) 염기서열 분석

1. 아가로즈 젤 제제
   1. 아가로즈 파우더 1.5g을 측정하고 분말을 100mL의 1x TAE 버퍼와 마이크로웨이브 플라스크에 섞어 (1.5% 아가로즈 젤의 결과).
   2. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 1-3분 간 전자레인지에 조리합니다.
      참고: 일부 버퍼가 증발하여 젤의 최종 아가로즈 백분율을 변경하므로 솔루션을 과도하게 끓이지 마십시오.
   3. 아가로즈 용액을 약 50°C로 식힙니다.
   4. 아가로즈 용액에 10 μL 10,000x 형광 핵산 염료를 추가합니다.
   5. 아가로즈를 젤 트레이에 붓고 잘 빗을 제자리에 놓습니다. RT에서 완전히 굳어지기 전까지 20-30분 동안 그대로 둡니다.
2. 시퀀싱
   1. RT-PCR 제품 5μL(4.4단계)과 6배 적재 버퍼1μL을 혼합합니다. 1.5% 아가로즈 젤의 우물에 적재하십시오.
   2. 젤을 135 V에서 5분, 120V에서 20분 동안 실행합니다.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 트랜실루미나이터를 사용하여 밴드를 시각화합니다.
   4. 젤에서 관심있는 소비제 밴드와 RT-PCR 제품을 검색하기 위해 젤 및 PCR 정리 키트를 사용합니다.
   5. 분광계를 사용하여 농도를 측정합니다.
      참고: Sanger 시퀀싱 장비가 사내에서 제공되지 않는 경우 회사 또는 시퀀싱 시설에서 시퀀싱을 위해 정제 된 밴드를 보낼 수 있습니다.
   6. 표 4에따라 사이클 시퀀싱 키트 및 파이펫에 필요한 시약을 다중 플레이트 PCR 플레이트에 준비한다. 프라이머 시퀀스의 표 2를 참조하십시오.
   7. 투명 접착제 필름으로 접시를 밀봉합니다.
   8. 2-3s의 플레이트를 소용돌이시다. 원심분리기는 스윙 버킷 원심분리기에서 짧게 하여 내용물들이 1,000 x g의우물 바닥(5~10s)에 정착하도록 한다.
      참고: 기포는 우물에 존재할 수 있지만 반응에 부정적인 영향을 미치지는 않습니다.
   9. 혼합물을 열 순환기에 넣고 표 5에따라 실행합니다.
   10. 제조업체의 지시에 따라 플레이트로 시퀀싱 반응을 정화합니다.
   11. DNA 분석기를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 서열을 결정합니다.
   12. 환자의 예상 서열에 얻은 서열을 비교합니다.

7. 웨스턴 블로팅

1. 샘플 준비
   1. SDS 샘플 버퍼 준비(4% SDS, 4M 우레아, 10% 2-mercaptoethanol, 10% 글리세롤, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% 브로모페놀 블루, 프로테아제 억제제).
   2. 150μL의 SDS 버퍼에서 저온 절개에서 수집된 10μm 근육 섹션의 약 100개의 조각을 놓습니다.
   3. 편리한 마이크로 균질화제를 사용하여 30 초 동안 얼음에 단백질 샘플을 간략하게 균질화합니다.
   4. 16,500 x g의 원심분리기는 15분 동안 상류체를 신선한 튜브로 옮긴다. -80°C에서 분석 또는 저장을 진행합니다.
2. 단백질 농도 측정을 위한 SDS-PAGE
   참고: 형광젤 얼룩이 단백질 농도를 결정하는 데 사용되었습니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 정상적인 건강한 대조군 시료 중량 및 농도를 결정합니다.
   2. 젤 전기 전광에 대한 샘플을 준비합니다. 건강한 대조군의 총 단백질의 파이펫 10 μg, 환자 샘플의 5 μL, 4배 샘플 버퍼 5μL, 10배 시료 환원제 2μL. 이러한 물을 혼합하면 각 샘플에 20 μL의 최종 부피에 탈이온 된 물을 추가하십시오.
   3. 70°C에서 10분 동안 시료를 가열합니다.
   4. 40x SDS 실행 버퍼의 50mL를 사용하여 1x SDS 실행 버퍼 2,000mL를 준비합니다. 1,950mL의 탈온화된 물로 희석합니다.
      참고: 이 시점에서 실행 버퍼의 1,000mL로 충분합니다. 나머지 1,000mL 버퍼는 7.3.1 단계에서 사용됩니다.
   5. 철저하게 혼합하고 젤 박스의 하부(외부) 완충챔버에 사용하기 위해 1x SDS 실행 버퍼의 800mL을 따로 둡니다.
   6. 전기 포머시스 직전에, 젤 박스의 상부 (내부) 완충챔버에서 사용하기 위해 1x SDS 실행 버퍼의 200 mL에 항산화 버퍼 500 μL을 추가합니다.
   7. 제조업체의 프로토콜에 따라 3-8% Tris-acetate 젤을 설정하여 젤 전기전도를 준비하십시오. 각 샘플의 20 μL을 젤에 적재합니다.
   8. 75분 동안 150V에서 전기전도를 수행합니다.
   9. 전기 전광 후, 형광 젤 얼룩 용액의 50 mL를 포함하는 깨끗한 트레이에 직접 젤을 배치합니다.
   10. 트레이를 덮고 셰이커에 놓고 액체를 튀기거나 젤을 90분 동안 손상시키지 않고 동요합니다.
   11. 형광을 검출하기 위해 에티듐 브로마이드 방출 필터와 312 nm 조명에서 형광 시스템에서 이미징하기 전에 물로 젤을 전송합니다.
   12. 공지된 농도를 가진 정상 대조용 용액을 사용하여 생성된 분석 곡선을 기반으로 환자 샘플의 농도를 측정한다.
3. 서부 블로팅용 SDS 페이지
   1. 7.2.4-7.2.6 단계에 따라 젤 박스를 준비한다.
   2. 7.2.11 단계에서 얻은 농도 측정에 기초하여, 건강한 제어 용액의 차선 당 100 μg 및 환자 샘플의 차선 당 300 μg를 적재한다. 7.2.7 단계와 동일한 설정을 사용하는 전기 전극.
4. 단백질 전달
   1. 전송 버퍼를 준비합니다. 메탄올에 20s에 PVDF 멤브레인을 담그십시오. 사용할 때까지 블로팅 버퍼 B로 이동합니다.
   2. 버퍼 당 최소 30분 동안 버퍼 A, B 및 C에 초두꺼운 블로팅 용지를 담급니다.
   3. 전기 전구 후, 5 분 동안 블로팅 버퍼 B에 젤을 담그십시오.
   4. 도 1의도면에 따라 반건조 전달 기계에 블로팅 용지, PVDF 멤브레인 및 젤을 놓습니다. 젤과 멤브레인 사이에 롤러로 기포를 굴립니다.
   5. RT에서 1h로 2mA/cm² 멤브레인으로 이송합니다.
      참고: 전송 후, 큰 분자량 단백질의 성공적인 전달을 확인하기 위해 Ponceau 염색과 유사한 총 단백질 얼룩을 수행하는 것이 좋습니다.
5. 차단 및 항체 염색
   1. PBST(0.1% 트위엔 20으로 1배 PBS)로 멤브레인을 두 번 헹구는다.
   2. 멤브레인을 1% 차단제에 놓고 RT에서 1h로 부드럽게 흔들어 차단합니다.
   3. 차단 용액(1:125) 및 항 스펙트럼 항체(1:25,000)에서 항 영양판 항체로 멤브레인을 RT 또는 4°C에서 1시간 동안 배양한다.
   4. RT에서 PBST로 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.
   5. RT에서 40분 동안 PBST(1:100)에서 고추냉이 과산화제(HRP)-공주 된 이차 항마우스/토끼 항체로 멤브레인을 배양한다.
   6. RT에서 PBST로 10분 동안 멤브레인을 다시 세 번 씻으십시오.
6. 검색
   1. 1:1의 비율로 검출 솔루션 A와 B를 혼합합니다. 필요한 검출 시약의 최종 부피는 0.1 mL/cm² 멤브레인입니다.
   2. 세척 된 멤브레인에서 과도한 PBST를 제거하고 플라스틱 랩 시트 또는 기타 적합한 깨끗한 표면에 단백질 측면을 올려 놓습니다. 혼합 검출 시약을 멤브레인에 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
   3. 막을 집게에 부드럽게 잡고 조직에 대한 가장자리를 터치하여 과도한 검출 시약을 제거합니다.
   4. 얼룩 단백질 면을 샘플 트레이에 올려 놓습니다. 사용자 설명서에 따라 형광 시스템을 작동합니다. 다음과 같이 기계를 설정합니다. 노출 유형: 증분, 간격 시간: 10s, 감도/해상도: 높음.
      참고 : 측정 된 영역은 파란색 사각형(그림 4a-b)입력 : 배경; D: 디스트로핀 427 kDa, SL: 스펙트린 베타 롱 아이소폼 (274 kDa); SS: 짧은 등포 (253 kDa). 디스트로핀/스펙트린 신호 비율은 (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]로 계산하였다. 일반 제어 비율은 100%로 설정되었습니다.

결과

RT-PCR을 사용하여 엑슨 건너뛰기를 감지하려면, 건너뛰게 될 엑슨의 양쪽에 프라이머가 특정 밴드만 산출하도록 설계 및 평가되었습니다(엑슨 건너뛰기 및 프라이머 위치의 회로도 2 참조). 프라이머는 MCE를 사용할 수 없는 경우 MCE 시스템 또는 일반 아가로즈 젤 전기포에 크기로 쉽게 구별할 수 있는 제품을 생성해야 합니다. 도 3는a 용량 에스컬레이션 단계 1 시험에서 NS-065/NCNP-01을 치료 전후한 환자 NS-03 및 NS-07로부터 건너뛴 밴드의 RT-PCR 반응 및 시퀀싱 결과의 MCE 시스템 A 겔 영상을 나타낸다. NS-03 및 NS-07 항만 삭제는 각각 45-52 및 48-52에 걸쳐 있습니다. NS-03받은 5 mg/kg 및 NS-07 20 MG/kg NS-065/NCNP-01 주간 12 주 동안. 치료 전에 예상대로, 두 환자는 건너 뛰지 않는 것으로 나타났으며, 건너 뛴 밴드만 시각화할 수 있었습니다. 치료 12 주 후, NS-07에 대한 명확한 건너 뛴 낮은 밴드를 시각화했다. 그러나 환자 NS-03을 위해 건너뛴 제품을 감지하는 것은 여전히 어려웠습니다. 시퀀싱 결과는 NS-07에 대한 엑슨 47 및 54뿐만 아니라 NS-03에 대한 엑슨 44 및 54의 연결을 보여 주었다. 서열에 따르면, 이들은 이론적으로 기능적이지만 단축 된 dystrophin isoform을 생성 할 수 있습니다. 도 3b에표시된 건너뛰는 백분율을 계산하기 위해 건너뛴 대역에 대한 어금음 농도는 건너뛰고 건너뛰지 않은 대역으로 나뉘었다. 환자 NS-07의 경우, 치료 후 비율은 72%였으며 NS-03의 경우 3.4%였습니다. 환자 NS-03, NS-07 및 건강한 대조군으로부터의 서양 얼룩 데이터(triplicate)는 도 4에a도시된다. 예상대로, 치료 전에 디스트로핀 밴드가 검출되지 않았습니다. 치료 후 환자 NS-07로부터의 대역은 건강한 대조군(야생형 디스트로핀은 427kDa의 분자량을 가지며, NS-07 디스트로핀은 389kDa의 분자량을 가지고 있음)에 비해 저분자로 검출되었다. 엑슨 삭제 및 건너뛰기 때문에 환자 NS-07의 dystrophin isoform에는 여러 개의 엑슨이 부족했으며 분자량이 낮아질 것으로 예상되었습니다. 환자 NS-03 치료 후 dystrophin의 검출 수준을 보여주지 않았다. 도 4b에서,환자 NS-07에 대한 건강한 대조군과 비교하여 디스트로핀의 양이 나타난다. 디스트로핀 복원 계산을 위해 신호 강도가 측정된 위치는 파란색 사각형으로 표시됩니다. 디스트로핀 스펙트럼 비율은 건강한 대조군의 양에 비해 디스트로핀의 양을 계산하는 데 사용되었습니다. 이를 위해, 디스트로핀 마이너스 배경으로부터의 신호는 두 스펙트린 아이소폼(길고 짧음) 마이너스 배경의 합으로 나뉘었다(8.6.5단계 참조). 건강한 대조군 비율은 100%로 설정되었습니다. 치료 후 환자 NS-07의 건강한 대조군과 비교하여 디스트로핀의 양은 9.1%였다. 그러나, 백분율은 약한 dystrophin 밴드 때문에 환자 NS-03를 위해 계산될 수 없었습니다, 이는 두 환자에 대한 이전 처리 견본을 위해 얻은 것과 유사합니다.

그림 1: 서부 얼룩 분석을 위한 전송 스택의 회로도. 하단에 블로팅 버퍼 A에 담근 블로팅 종이가 있는 서쪽 블롯 전달 스택의 어셈블리는 블로팅 버퍼 B, PVDF 멤브레인, 3-8% Tris-Acetate Gel 및 블로팅 버퍼 C에 담근 상위 2개의 블로팅 용지에 담근 종이를 블로팅하는 것으로 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: DMD 유전자에서 엑슨 45-52 삭제를 가진 환자에서 엑슨 53의 엑슨 건너뛰기의 회로도 도면. 예를 들어, 투여량 에스컬레이션 임상 시험에서 환자 NS-03은 이러한 삭제를 하였다. 엑슨(53)이 유지되면, mRNA는 엑슨(44)과 53사이의 엑슨-엑슨 접합이 판독 프레임을 방해하여 엑슨 53에서 스톱 코돈이 생기기 때문에 프레임이 꺼질 것이다. 디폰(53)을 건너뛰면 판독 프레임이 복원되고, 디스트로핀의 짧은 등산체가 생성됩니다. RT-PCR에 의해 엑슨 53 건너뛰기를 감지하기 위해, 엑슨 44 및 54의 프라이머가 사용되어 건너 뛰고 건너뛰지 않은 mRNA 사이의 PCR 생성물을 쉽게 감지할 수 있습니다. FWD: 포워드 프라이머, REV: 역 프라이머, PMO: 인포로디아타테 모르폴리노 올리고머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 티비알리스 전방 근육 생검 샘플에서 환자 NS-03 및 NS-07을 위한 효율성을 건너뛰는 것입니다. a)환자 NS-03 및 NS-07로부터 치료되지 않은 및 처리된 샘플의 RT-PCR 샘플의 전기전경 시스템에 의해 생성된 젤 영상. 상부 패널은 삼중 패널에서 NS-03 및 하부 패널 NS-07을 보여줍니다. NS-03의 경우 건너뛴 대역은 422bp이고 건너뛴 대역은 212bp입니다. NS-07의 경우 밴드는 각각 836bp및 624bp입니다. 서열 분석은 NS-03및 엑슨(47)에 대한 엑슨(44)과 엑슨(54)의 합의를 NS-07에 대해 54로 나타났다. b)환자 NS-03 및 NS-07환자에 대한 검사 의 전과 후의 효율을 건너뛰는 것은 시스템 A가 건너뛰는 밴드/(건너뛴 대역+건너뛴 대역) x 100으로 시스템 A에서 제공하는 어금니 농도로부터 계산된다. NS-03에 대한 건너뛰는 효율은 치료 후 매우 낮았습니다. NS-07의 경우 건너뛰는 효율이 70% 이상이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 엑슨 건너뛰기 치료 전후에 Dystrophin isoforms의 단백질 정량화. a)엑슨 건너뛰기 치료 전후에 디스트로핀 이소폼의 단백질 정량화. 환자 NS-03 및 NS-07 환자에서 티비알리스 전방에서 근육 생검의 서쪽 얼룩 치료 전후 및 삼중에서 건강 한 제어에서. Dystrophin은 건강한 제어를 위한 427 kDa에서 볼 수 있고 치료 후 NS-07에 대한 389 kDa에서 볼 수 있습니다. 치료 전에 환자를 위해 어떤 dystrophin도 검출될 수 없습니다, 또는 어느 쪽도 환자 NS-03를 위한 처리 후에 검출될 수 없었습니다. 블랙박스의 영역은 그림 4b에표시됩니다. 각 블롯의 왼쪽에 마커가 표시됩니다. b)환자 NS-07에 대한 치료 후 복원 된 dystrophin의 양. Dystrophin 복원은 소화식에 따라 디스스트로핀, 배경 및 스펙트럼의 길고 짧은 등색체에 대한 밴드의 강도를 기반으로 계산되었습니다: (dystrophin - 배경)/(스펙트럼 L-배경) + (스펙트린 S - 배경) 건강한 제어를위한 비율이 100 %로 설정되어 있습니다. 각 밴드의 강도는 그림에 표시된 파란색 상자 내부로 측정되었다. NS-07의 디스트로핀 복원은 치료 후 9.1%였다. 디스트로핀 신호는 처리되지 않은 샘플에서 측정하기에너무 약했습니다. 마커 크기는 킬로달톤으로 표시됩니다. Dystrophin, BG: 배경, SL: 스펙트린 긴 동소형, SS: 스펙트린 짧은 동소형태, 내: Myosin 타입 1. 마커 크기는 킬로달톤으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

솔루션	부피/반응(μl)	최종 농도
RNase 가 없는 물(제공)	변수	-
5x QIAGEN 원스텝 RT-PCR 버퍼	5.0	1x
dNTP 믹스(각 dNTP의 10mM 포함)	1.0	각 dNTP의 400 μM
포워드 프라이머 (10 μM)	1.5	0.6 μM
역프라이머 (10 μM)	1.5	0.6 μM
QIAGEN 원스텝 RT-PCR 효소 믹스	1.0	-
RNase 억제제 (선택 사항)	변수	5-10 단위/반응
템플릿 RNA	50 ng
총	25

표 1: RT-PCR 시약. RT-PCR의 한 반응에 필요한 화합물.

뇌관	시퀀스
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAAA가카가카가카가-3'
48F	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCACTCCTT-3'
54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

표 2: 프라이머 목록입니다. 이 연구에서 사용되는 프라이머에 대한 시퀀스. F: 앞으로, R: 역.

1 주기	역전사	30분	50 °C
1 주기	초기 PCR 활성화 단계	약 15분	95°C
35사이클	변성	1분	94°C
	어 닐 링	1분	60 °C
	확장	1분	72 °C
1 주기	최종 확장	7분	72 °C
개최		∞	4°C

표 3: PCR 컨디셔닝 된 사용. RT-PCR 반응에 대한 PCR 조건을 표시합니다.

솔루션	부피/반응(μl)
RNase 가 없는 물	변수
빅디 터미네이터 3.1 준비 반응 믹스	3.5
포워드 프라이머/리버스 프라이머(3.2 μM)	2.0
템플릿 RNA	20 ng
총	20

표 4: 시퀀싱 반응에 필요한 시약입니다. 둘 다 동시에 설정에서 앞으로 또는 역 프라이머를 사용합니다.

1 주기	1분	96°C
25 사이클	10 s	96°C
	5 s	50 °C
	4분	60 °C
개최	∞	4°C

표 5: Sanger 시퀀싱을 위한 PCR 조건입니다.

토론

DMD의 임상 시험은 지난 몇 년 동안 성공과 실패를 모두 생산했습니다. RT-PCR과 서부 블로팅은 환자에게 투여되는 엑슨 건너뛰는 화합물에 의해 생성된 건너뛰는 효율을 평가하는 일반적인 기술이다. 그러나 RT-PCR은 디지털 PCR^15에비해 건너뛰는 효율을 과대 평가한 것으로 보고되었다. 이것은 여러 가지 이유로 인해 발생하지만, 주로 PCR 주기 동안 작은 건너 뛴 조각의 보다 효율적인 증폭에 의해 발생합니다. 이 임상 시험에 사용된 RT-PCR도 서양 블로팅에 의해 추정된 단백질 발현에 비해 더 높은 건너뛰는 효율성을 생성한 것으로 보인다. FDA에 따르면, 이것은 dystrophin 복원을 정량화하는 더 신뢰할 수있는 방법입니다^12. 따라서 RT-PCR 건너뛰기 결과를 해석할 때주의해야 합니다. 그러나 샘플은 여전히 비교할 수 있습니다. RT-PCR 결과에 근거를 둔 더 높은 건너뛰는 효율성을 보여주는 견본은 일반적으로 서쪽 blot 분석에서 더 높은 단백질 발현 수준을 exhbit.

DMD 임상 시험에 있는 모든 환자는 동일 삭제 패턴을 가지고 있지 않기 때문에, 모든 견본에 디지털 또는 qPCR를 능력을 발휘하기 위하여 적당하게 특정한 프라이머 및 프로브를 디자인하기 어려울 수 있습니다. 따라서 RT-PCR은 여전히 건너뛰는 효율성에 대한 첫 번째 평가를 위한 좋은 대안입니다. NS-065/NCNP-01의 임상 시험이 시작되기 전에 근육이나 피부 생검이 환자 별 근막을 생성하는 것이 필수적이었기 때문에 체외내의 각 환자에 대한 건너뛰는 효율을 평가하는 것은 지루했습니다. 그러나, 최근에는 새로운 DMD 근육세포^모델로서환자특이적 MYOD1 변환, 소변 유래 세포(UDCs)를 생성하는 새로운 기술을 최근에 발표했다. 따라서, 환자로부터 수집된 소변만 근막을 생성하기 위해 필요하며, 침습적 절차가 필요하지 않다. 우리는 이 방법이 환자 특정 세포에 있는 다른 AON을 스크린하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 믿습니다. 더욱이, 환자가 어떤 임상 시험을 시작하기 전에 다른 프라이머와 프로브는 시험될 수 있습니다. 이를 통해 향후 DMD 임상 시험에서 엑슨 건너뛰기 측정을 위한 qPCR 또는 디지털 PCR사용을 용이하게 할 수 있다.

이 임상 시험에서 서양 얼룩 분석을 수행하기 위해, dystrophin에 대하여 단 하나 항체가 이용되고, 단지 하나의 건강한 통제가 참조 견본으로 이용되었습니다. 따라서, 항체의 특이성은 적절히 검증되지 않았다. 이것은, 항체가 dystrophin의 C-말단 도메인을 인식한다는 사실과 더불어, 프로토콜의 한계입니다. dystrophin 분자의 다른 도메인에 대하여 더 건강한 통제 및 항체는 미래에 추천합니다.

여기에서, 우리는 NS-065/NCNP-01의 최근 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 사용된 프로토콜을 요약했습니다. NS-065/NCNP-01은 DMD 환자의 10.1%에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 bp DNA 사다리	Takara	3407A	마커 솔루션, MultiNA
1mol / l-Tris-HCl 버퍼 솔루션 (pH 7.6)	Nacalai	35436-01
2- 메르 캅토 에탄올	Nacalai	21418-42
2- 메틸 부탄 (이소 펜탄)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관	Falcon	352235
6&타임스; 로딩 버퍼	Takara	9156
Agarose ME	Iwai chemical	50013R
Applied Biosystems 3730 DNA 분석기	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트	Applied Biosystems	4337455
소 혈청 알부민 용액	: Sigma-Aldrich	A8412
Bromophenol blue	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-Well Plates	Applied Biosystems	4367819
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime Blocking Reagent	GE healthcare	RPN418
ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약	GE 헬스케어	RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion 자동 전기영동 스테이션	Bio-Rad	7007010	마이크로칩 전기영동 시스템 10
용 Experion DNA 1K 분석 키트	Bio-Rad	7007107JA
Experion 프라이밍 스테이션	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
Extra Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed 핵산 젤 스테인	Biotium	41003
유리 바이알	이와키	1880 SV20
글리세롤	Nacalai	17045-65
Histofine Simple Stain MAX PO	Nichirei	424151
호스 세럼	Gibco	16050122
Immobilon-P Transfer Membrane	Millipore	IPVH304F0
ITS 액체 매체 보충제	Sigma-Aldrich	I3146
메탄올	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp 투명 접착 필름	적용 Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	마이크로칩 전기영동 시스템 B
Multiplate 96-Well PCR 플레이트	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계 Wi-Fi Thermo	Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM 동결건조 마우스 단클론 항체 디스트로핀(C-말단)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM 동결건조 마우스 단클론 항체 Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS 샘플 완충	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041
Oriole Fluorescent Gel Stain	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin 용액 안정화	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron 핸디 마이크로 균질화기 MICROTEC		NS-310E3
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23227
폴리브레인 감염/형질주입 시약	Sigma-Aldrich	TR-1003
프로피듐 요오드 염색 용액	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep RT-PCR 키트	Qiagen	210212
RNeasy 섬유 조직 미니 키트	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
반건조 전사	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494	for MultiNA
TAE Buffer	Nacalai	35430-61
Tragacanth Gum	Wako	200-02245
Tris-EDTA 완충액	Nippon Gene	316-90025	for MultiNA
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Urea	Nacalai	35907-15
Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System	Promega	A9281
XCell SureLock 미니 셀	Invitrogen	EI0001