Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

요약

본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.

초록

미묘한 행동 변경에서 말기 치매에, 혈관 인식 손상은 전형적으로 대뇌 허혈 다음 발전합니다. 뇌졸중과 심장 마비는 현저하게 성적으로 이형질환이며, 둘 다 대뇌 허혈을 유발합니다. 그러나, 혈관 인지 장애를 이해 하 고 다음 성 별 치료를 개발에 진행, 기능 연구에서 마우스 모델에서 뇌 미세 순환을 조사에 의해 부분적으로 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌에서 전 생체 내 해모모세-자영-자영 아테리올(HiCaPA) 준비에서 모세관-아티올 신호신호를 검사하는 접근법을 제시한다. 우리는 모세관 자극에 응하여 동맥 직경을 측정하기 위하여 미세 순환을 분리, 통조림 및 가압하는 방법을 기술합니다. 우리는 HiCaPA 제제 무결성을 검증하고 신경 혈관 커플링 제로 칼륨을 테스트하고 Kir2 안쪽정류 칼륨 채널 패밀리, ML133의 최근 특징 억제제의 효과를 포함하여 전형적인 결과를 표시하는 데 사용할 수있는 적절한 기능 적 제어를 보여줍니다. 또한, 우리는 남성과 여성 마우스로부터 수득된 제제에서의 반응을 비교한다. 이러한 데이터는 기능적 조사를 반영하는 반면, 우리의 접근 방식은 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학 연구에서도 사용될 수 있습니다.

서론

뇌 표면의 pial 순환은 많은 연구의 대상이되었습니다, 부분적으로 때문에 실험 접근성. 그러나 대뇌 혈관 구조의 토폴로지는 뚜렷한 영역을 만듭니다. 혈류를 리디렉션하기위한 실질적인 용량을 가진 해부학이 풍부한 견고한 pial 네트워크와는 달리, 내측 중골 동맥 동맥 (PA)은 제한된 부수적 공급을 제시하며, 이들 각각은 신경 조직의 개별 부피를^교배1,2. 이것은 독특한 생리적 특징^{3,4,5,6,7,8과}결합하여 뇌혈류(CBF) 조절^9,10을위한 중요한 부위로 뇌내 동맥을 만드는 혈류에 병목 현상 효과를 일으킨다. PA의 격리 및 통조림에 내재된 기술적 과제에도 불구하고, 지난 10년 동안 가압용기

프로토콜

모든 실험은 콜로라도 대학, 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션

1. 해부를 위해 MOPS 버퍼링 식염수를 사용하고 시료를 사용 전에 4 °C로 유지하십시오. 용액을 가스로 사용하지 마십시오. 다음 조성으로 MOPS 완충 식염수 준비: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH₂PO_4,1 mM MgSO_4,2.5 mM CaCl_2,5 mM 포도당, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL 소 세루민, 30 mg/mL 소 세루민, 30 mg/mL 소 세루민 을 준비한다.
2. 인공 뇌척수액(aCSF)을 목욕 용액 및 파이펫 용액으로 사용하십시오. 가스 모두 ACSF 및 Ca²⁺-free aCSF 5% CO_2,20% O₂및 N₂ 균형. 다음 조성물로 용액을 준비: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO_3,1.25 mM NaH₂PO_4,

결과

내피 소형 전도도 (SK) 및 중간 전도도 (IK) Ca^{2 +}-민감한 K⁺ 채널은 PA의 직경에 경악영향을 미칩니다. 1 μM NS309의 목욕 적용, 합성 IK 및 SK 채널 작용제, 거의 최대 팽창 발생(그림 2A,B). 그러나, 모세관 내피 세포는 IK 및 SK 채널이 부족하고 NS309^20에대한 반응으로 과분극화되지 않았다. 그 결과, 모세관을 자극하는 것은 초점 압력 배출(20s, 5 psi)에 의해 1 μM NS309로 끝나며 상류 동맥 팽창을 일으키지않았다(도 2A, B). 이러한 결과는 NS309가 HiCaPA 제제에서 동맥에 도달하지 못했고 압력 배출에 의해 모세혈관에 가해지는 화합물의 공간 적 제한을 평가하.......

토론

본 원고에 기재된 가압 HiCaPA(해모세혈관-자영형 동맥) 제제는 중증 모낭 동맥 을 분리, 가압 및 연구하기 위한 당사의 잘 확립된 절차의 연장체이다^29. 최근 뇌 모세관 내피 세포에서 Kir2.1 채널이 신경 활성화와 관련된 [K^+]_o에서 감각이 증가하고, 상류 동맥^20을팽창시키는 오름차순 과극성 신호를 생성한다고 보고하였다. 모세 혈관에 대한 이전에 예기치 않은 역할을 밝히는 것은 부분적으로 피질 미세 순환^20,21에서CaPA 준비를 개발함으로써 가능했습니다. 이 원고는 유사한 실험 적인 접근을 제시하지만 신경 혈관 커플링 동안 모세관 - 동맥 신호를 조사하기 위해 간단하고 재현 가능한 접근 방식을 설명하기 위해 마우스 뇌의 더 깊고 제한된 구조에서.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22&마이크로; m 주사기 필터	CELLTREAT Scientific Products	229751
12-0 나일론(12cm) 검은색	미세 수술 기구, Inc	S12-0 나일론
자동 온도 조절기	Warner Instruments	TC-324B
붕규산 유리 외경: 1.2mm, 내경: 0.68mm	Sutter Instruments	B120-69-10
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A7030
CaCl2 이수화물	Sigma-Aldrich	C3881
D-(+)-포도	Sigma-Aldrich	G5767
해부 범위	Olympus	SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 & 드라이브 및 MS/CA가 있는 완전한 펌프 4-12 펌프 헤드	Ismatec	ISM 1090
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
파인 가위 - 샤프	파인 사이언스 툴	14063-09
인라인 워터 히터	워너 인스트루먼트	SH-27B
Integra™ 밀텍스&트레이드; 조직 겸	Fisher Scientific	12-460-117
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Sigma-Aldrich	M1880
MgCl 무수	Sigma-Aldrich	M8266
Micromanipulator	Narishige	MN-153
ML 133 염산염	Tocris	4549
MOPS	시그마-알드리치	M1254
NaCl	시그마-알드리치	S9625
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NS309	Tocris	3895
Picospritzer III - 세포 내 미세사출 디스펜스 시스템, 2채널	Parker Hannifin	052-0500-900
연동 펌프가 있는 압력 서보 컨트롤러	리빙 시스템 기기	PS-200
피루브산 나트륨	Sigma-Aldrich	P3662
초극세 집게	Fine Science Tools	11252-20
수술용 가위 - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14001-13
수직 마이크로피펫 풀러	Narishige	PP-83

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