여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.
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방법 논문
2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출
이 논문에서
요약
초록
산화 스트레스는 생리학적 및 병리학 적 조건 모두에서 중요한 사건이다. 본 연구에서는 대장암 세포주에서 염색하는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 반응성 산소 종(ROS)을 측정하여 산화 스트레스를 정량화하는 방법을 보여 준다. 이 프로토콜은 DCFH-DA 솔루션 의 준비, DCFH-DA 용액을 가진 세포의 인큐베이션 및 정규화된 강도의 측정을 포함한 상세한 단계를 설명합니다. DCFH-DA 염색은 세포에서 ROS를 검출하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 그것은 화학 적 치료 또는 유전자 변형 후 ROS 생성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 환경 스트레스에 세포 산화 스트레스를 결정에 유용, 기계학 연구에 단서를 제공.
서론
생리학적 의미의 세포 대사에 의해 생성되는 3개의 주요 반응성 산소 종(ROS)은 초산화수소 음이온, 하이드록실 라디칼 및 과산화수소1이다. 낮은 농도에서, 그들은 생리 세포 과정에 참여, 하지만 높은 농도에서 그들은 세포 신호 경로에부작용1. 우리 몸은 과도한 ROS에 효과적인 항산화 시스템을 개발했습니다. 그러나, 산화 스트레스는 ROS가 염증, 암 및 신경 퇴행성 질환2,,3,,4를포함한 많은 병리학 적 조건에 기여하는 우리 몸의 해독 능력을 압도 할 때 발생할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 부착된 세포에서 총 세포 ROS를 결정하는 것이다. 그 근거는 DCFH-DA에서 2'-7'dichlorofluorescein (DCF)의 산화가 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 이산화질소 (•NO2)를포함한 총 ROS 검출을 위해 광범위하게 사용되었다는 것입니다. 기계적으로, DCFH-DA는 세포 esterase가 아세틸 군에서 갈라지는 세포에 ....
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프로토콜
1. 셀 시드
- 종자 2 x 105 HCT116 대장암세포는 24웰 플레이트에서 잘 되어 있으며, 37°C에서 하룻밤 사이에 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)에서 세포를 유지한다.
- 배양 배지를 100μM 철황산염(FS) 또는 10μM 독소루비신(DOX)의 배지 및 인큐베이트 24시간 없이 교체한다.
2. DCFH-DA 솔루션 준비
- 디메틸 설산화물(DMSO)의 1mL에 DCFH-DA 4.85 mg을 용해하여 10mM 스톡 용액을 만듭니다.
- 미리 데워진 DMEM으로 스톡 솔루션을 10 μM 작업 솔루션으로 희석한 후 우물에 추가합니다.
- 10초용 작업 용 솔루션.
3. DCFH-DA 염색
- 매체를 함유한 약물을 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오.
- DCFH-DA 작업 용액의 500 μL을 각 우물에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- DCFH-DA 작업 솔루션을 제거합니다. DMEM으로 한 번 씻고 1배 인산완충식식염수(PBS)로 2배 세척합니다.
- 각 웰에 1x PBS의 500 μL을 추....
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결과
HCT116 대장암세포는 산화응응을 유도하기 위해 100μM FS 또는 10 μM DOX로치료되었다. 도 1에도시된 바와 같이, 녹색 형광은 예상대로 FS와 DOX 모두에 의해 극적으로 증가되었다. 상대강도 변화를 정량화하기 위해, 세포를 촬영한 후 리즈화하고 단백질 농도로 정상화하였다. 정량화형 형광 강도는 HCT116 세포에서 FS 또는 DOX에 의해 현저하게 증가하였다.
그림 1: 철제 치료는 대장암세포에서 ROS를 증가시킨다. 형광 현미경 및 강도 정량화에 의해 촬영 된 대표적인 형광 이미지 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 이아세테이트.......
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토론
여기에 설명된 실험 프로토콜은 세포 총 ROS를 측정하기 쉽게 재현할 수 있습니다. 중요한 단계에는 DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고, 세포 상태 방해를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척이 포함됩니다. DCFH-DA 작업 솔루션의 준비를 위해 재고 솔루션은 24 웰 플레이트에 추가하기 직전에 미리 따뜻해진 DMEM에 추가되어야 합니다. 그 이유는 높은 배경 형광 또는 광 노출을 생성하는 오래된 솔루션이 광표백으로 이어질 것이기 때문입니다. 대부분의 연구는 1x PBS 또는 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 사용하여 DCFH-DA를 희석시키고 반응 버퍼10으로사용합니다. 그러나, HCT116 및 RKO를 사용하는 경우, PBS및 태아소 혈청무료 DMEM을 이용한 DCFH-DA 스톡 용액의 희석은 처리되지 않은 세포에서도 높은 배경 신호를 생성하였다. 이것은 셀 상태 장애 때문일 수 있습니다. 또한 DCFH-DA 작업 솔루션은 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 암 학회 (RSG-18-050-01-NEC)의 연구 학자 보조금인 국립 보건 원 (K01DK14390)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 연구 파일럿 프로젝트 보조금은 뉴멕시코 대학교 환경 건강 서명 프로그램 및 슈퍼펀드(P42 ES025589), 공유 자원 시범 프로젝트 상 및 UNM 종합 암 센터의 연구 프로그램 지원 파일럿 프로젝트 상(P30CA118100) 뉴멕시코 의과 대학의 전담 건강 연구 기금에서 새로운 조사자 상을 수상했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| 독소루비신 염산염 | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL 자동 이미징 시스템 | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | 또는 기타 형광 현미경 |
| 단백질 분석 Bradford 솔루션 | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | 또는 기타 형광 마이크로플레이트 리더 |
참고문헌
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-3....
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재인쇄 및 허가
