여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
RNA 침묵은 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된, 서열 특정 유전자 규칙 기계장치입니다. 몇몇 식물 병원체는 숙주 식물 RNA 침묵 통로를 억제하는 기능을 가진 단백질을 진화했습니다. 바이러스 이펙터 단백질과 는 달리, 단지 몇몇 분비 이펙터 단백질은 세균, 오미세테 및 곰팡이 병원체에서 RNA 침묵을 억제하는 능력을 보여주었으며, 대부분의 이펙터의 분자 기능은 크게 알려지지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 RNA 침묵을 관찰하고 식물 병원체에 의해 분비되는 이펙터 단백질을 특성화하는 일반적인 방법으로 작용할 수 있는 병입 분석법의 약간 변형된 버전을 상세히 기술한다. 접근법의 주요 단계는 건강하고 완전히 발달된 잎을 선택하고, 박테리아 배양을 600 nm에서 적절한 광학 밀도(OD)로 조정하고, 침윤에 대한 최적의 시간에 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 관찰하는 것입니다. 억제 활동이 약한 이펙터를 생략하지 않도록 합니다. 이 향상된 프로토콜은 RNA 침묵 억제제의 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝에 기여하고 이러한 단백질의 분자 기능을 조사하기 위한 훌륭한 출발점역할을 할 것입니다.
서론
지난 2년간 식물 질환을 유발하는 미생물의 게놈 염기서열 분석이 가속화되면서 서열 정보와 인코딩된 단백질의 생물학적 기능 사이의 지식 격차가 계속 증가하고 있다1. 시퀀싱 프로젝트에 의해 밝혀진 분자 중에는 선천성 면역을 억제하고 숙주 식민지화를 촉진하는 이펙터 분자가 있습니다. 이 요인은 박테리아, 선충 및 필라멘트 미생물을 포함하여 파괴적인 식물 병원체에 의해 분비됩니다. 이러한 위협에 대응하기 위해 숙주 식물은 이러한 이펙터를 인식하는 새로운 수용체를 진화시켜 면역 반응을 회복시냅니다. 따라서, 이펙터는 병원체 계보 중 이펙터 레퍼토리의 다양화로 이어지는 다양한 선택적 압력의 대상이 된다2. 최근 몇 년 동안, 식물 병원균에서 putative 이펙터는 신호 경로의 dysregulation, 전사, 세포 내 수송, 세포 내 수송, 소포 인신 매매 및 RNA silencing3,4,5를포함하여 다양한 방법으로 미생물에 혜택을 호스트 세포 프로세스를 방해하여 식물 선천적 면역을 방해하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 병원체 이펙터의 대다수, ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 : 절차의 모든 단계는 실온 (RT)에서 수행해야합니다.
주의: 병원성 미생물을 함유한 모든 배지와 분석에 사용된 식물 및 식물 조직을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 용기 및 오토클레이브에 보관하십시오.
1. 퍼팅 이펙터를 포함하는 플라스미드 구조의 준비
- RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해 결정된 바와 같이 감염 중에 고도로 발현되는 분비 이펙터를 선택하고, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 기술에 의해 추가로 결정됩니다.
- SignalP18과같은 소프트웨어 도구를 사용하여 각 이펙터의 신호 펩타이드 절단 부위를 결정합니다.
- 프라이머를 설계하고 PCR을 수행하여 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 관심 있는 이펙터를 코딩하는 유전자를 증폭시한다. 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 PCR 생성물 확인후, 응찰이 없는 클로닝키트(표)를이용하여 pQBV3 게이트웨이 진입 벡터로 앰플리콘을 복제한 후, 이어서 LR 재조합반응(19)을이용하여 대상 발현 벡터 pEG100으로 들어간다.
- LR 반응 혼합물의 3-5....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
상술한 바와 같이, P. 소재 RxLR 이펙터의 RSS 활성을 평가하기 위한 개선된 스크리닝 분석에 대한 단계별 절차를 설명한다. 전부, 실험은 5-6 주가 걸립니다. 이어서, 분석에 의해 확인된 RSSs는 기능 및 분자 메커니즘의 측면에서 더욱 특징화될 수 있다. 우리의 접근의 일보기로, 우리는 감염 도중 haustoria를 통해서 분비되고 전달되는 RNA 침묵 1 (PSR1)의 P. sojae RxLR 이펙토 피토프토라 억제기를 사용했습니다.
PSR1이 RSS 활성을 가지고 있고 이 방법에 따라서 적합하다는 것을 확인하기 위해, 각각의 변형된 아그로박테리움 균주는 35S-GFP를 항하는 균주와 혼합하고 N. 벤타미아나 16c의 잎으로 침투하였다. EV 및 CMV2b는 각각 음극 및 양성 대조군으로 사용하였다(도<.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
RNA 침묵은 바이러스성, 세균성, 난균체 및 곰팡이 병원균에 대처하기 위해 식물에 의해 사용되는 주요 방어 메커니즘입니다. 차례로, 이들 미생물은 항바이러스 침묵을 중화하기 위해 침묵 억제 단백질을 진화시키고, 이들 RSSs는 RNA 침묵 경로22,23의상이한 단계를 방해한다. RSSS10을확인하기 위해 여러 스크리닝 검거가 개발되었습니다.
여기서, 우리는 P. sojae에 의해 분비된 이펙터 단백질을 숙주에서 RNA 침묵을 억제하는 그들의 능력에 대한 감염 시 숙주 세포내로 분비하는 개선된 프로토콜을 설명한다. 이 수정된 분석은 바이러스성 공동 침투 분석에 기초하지만 몇 가지 중요한 방법으로 다릅니다. 첫째, 박테리아와 N.benthamiana 16c 식물 모두 활발하고 건강해야합니다. 이것은 박테.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 사업은 상하이 교육개발재단과 상하이시 교육위원회의 "슈광 프로그램"의 보조금으로 지원되었으며, 중국 의 국가 핵심 R&D 프로그램( 2018YFD0201500), 중국 국립자연과학재단(제31571696호 및 31660510호), 중국 청년전문가를 위한 천인재 프로그램, 상하이시 과학기술위원회(18DZ2260500).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-모르폴리노에탄술폰산(MES) | Biofroxx | 1086GR500 | 버퍼 |
| 2xTaq 마스터 믹스 | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS 버퍼 |
| 아세토시링곤(AS) | 시그마-알드리치 | D134406-5G | 아그로박테리움 |
| 한천 | 유도Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB 매체 |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | 전기영동 |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern 블롯 |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB 매체 |
| Bacto 효모 추출 | BD Biosciences | 212750 | LB 매체 |
| 카메라 | Nikon | D5100 | 사진 |
| ChemiDoc MP 이미징 시스템 | Bio-Rad | ||
| 화학 발광 감지 모듈 dafa 키트의 구성 요소 | Thermo Fisher Scientific | 89880 | 발광 감지 |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | 항생제 |
| ClonExpress II 원스텝 클로닝 키트 | Vazyme Biotech | C112-01 | 결찰 |
| DIG Easy Hyb | 시그마-알드리치 | 11603558001 | 하이브리드화 버퍼 |
| Easypure 플라스미드 Miniprep 키트 | TransGen Biotech | EM101-02 | 플라스미드 추출 |
| EasyPure 퀵 젤 추출 키트 | TransGen Biotech | EG101-02 | 젤 추출 |
| EDTA 이나트륨 염 이수화물 | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS 완충기 |
| 전기 이동법 전력 공급 | LiuYi | DYY6D | 핵산 전기 이동법. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | 벡터 소화 |
| 젤 이미지 시스템 | Tanon | Tanon3500 | 이미지 |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | 항생제 |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | 항생제 |
| LR Clonase II 효소 | Invitrogen | 11791020 | LR 반응 |
| 니트로 셀룰로오스 블로팅 멤브레인 0.45um | GE 헬스케어 | 10600002 | 북부 |
| NORTH2south 비오틴 랜덤 프라임 DNA 라벨링 키트 | Thermo Fisher Scientific | 17075 | 비오틴 라벨링 |
| PCR 열 순환기 | Bio-Rad | T100 | PCR |
| 이탄 이끼 | PINDSTRUP | 다크 골드 + 점토 | 식물 |
| Peters 수용성 비료 | ICE | Peter Professional 20-20-20 | 비료 |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA 중합효소 | Vazyme Biotech | P505-d1 | 효소 |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | 항생제 |
| RNA 겔 로딩 염료 (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA 겔 로딩 염료 |
| 아세트산 나트륨 수화물 | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS 버퍼 |
| 염화나트륨 | Amresco | 0241-10KG | LB 매체 |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC 완충액 |
| Trizol 시약 | Invitrogen | 15596018 | RNA 절연 시약 |
| UV 램프 | Analytik Jena | UVP B-100AP | 관찰 |
| UVP Hybrilinker 오븐 | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
참고문헌
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
