우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.
이 논문에서
요약
초록
우리는 Drosophila에있는 모터 신경의 역행 표지를 위한 기술을 기술합니다. 우리는 오일 용해 된 친유성 염료를 사용하고 마이크로 인젝터에 의해 배아 필렛 제제에 작은 물방울을 전달합니다. 그 막이 물방울에 의해 접촉되는 각 모터 신경은 그 때 급속하게 표지될 수 있습니다. 개별 운동 뉴런은 지속적으로 라벨을 부착하여 미세한 구조적 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 친유성 염료가 다양한 색상으로 제공된다는 점을 감안할 때, 이 기술은 또한 인접한 뉴런을 여러 가지 색으로 표시할 수 있는 수단을 제공한다. 이 추적 기술은 따라서 Drosophila의모터 뉴런 시스템에서 신경 형태 형성 및 시냅스 연결을 연구하는 데 유용합니다.
서론
Drosophila의 배아 운동 뉴런 시스템은 중추 신경계 (CNS)1,2,3의발달의 기초가되는 메커니즘을 분석하는 강력한 실험 모델을 제공합니다. 모터 뉴런 시스템은 생화학적, 유전적, 이미징 및 전기 생리학적 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 유전 적 조작 및 기능 분석은 단일 운동 뉴런2,4,5,6의수준에서 수행 될 수있다.
신경계의 초기 발달 도중, neuroblasts는 분할하고 glia와 신경의 다수를 생성합니다. 신경아세포의 배분과 유전자 발현 프로필 사이의 시공간적 관계는 이전에 상세히 조사되어왔다 7,8,9. 운동 뉴런 시스템의 경우, 배....
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프로토콜
1. 장비 및 소모품
- 배아 를 수집하고 알을 낳기 위해 성인을 훈련하기위한 자료
- 튜브와 캡 사이에 100μm(재료표)의기공이 있는 메쉬 필터를 설정하도록 캡에 구멍을 열어 50 mL 튜브를 절단하여 여과 장치를 준비한다.
참고: 또는, 100 μm(재료표)의기공을 가진 세포 스트레이너는 배아 수집의 여과 단계에 사용될 수 있다. - 나열된 지침에 따라 포도 한천 프리 믹스(재료 표)로한천 접시를 만듭니다. 간단히, 분말 혼합물 1 패킷을 실온(RT, 23°C)dH2O의 500 mL로 부드럽게 저어주고 용해된 혼합물을 전자레인지에 넣고 힘차게 끓입니다. 70-75 °C로 냉각 한 후, 페트리 접시 (60mm)에 혼합물을 부어. 한천이 고화된 후 플레이트를 4°C로 저장합니다.
- 활성 건식 효모(재료표)와물을 페이스트 일관성에 혼합하여 효모 페이스트를 준비하고 4 °C에서 유지합니다.
- 충분한 공기 흐름을 제공하는 계란 수집 케이지 (60mm 페트리 접시, 재료 표)를사용합니다.
- 튜브와 캡 사이에 100μm(재료표)의기공이 있는 메쉬 필터를 설정하도록 캡에 구멍을 열어 50 mL 튜브를 절단하여 여과 장치를 준비한다.
- 해부 바늘 및 염료....
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결과
aCC 및 RP3 운동 뉴런의 대표적인 이미지는 15시간 AEL에서 운동 뉴런의 다색 라벨링을 입증하기 위해 도 3C에 도시되어 있다. 그들의 수지상 형태는 배아 사이에 크게 불변성입니다. 항-HRP 항체로 수득된 염색 패턴은 회색으로 나타내었다. DiO 또는 DiD의 작은 물방울은 각각 근육 1 또는 6/7의 NMJ에 증착되었다. 도 4는 관심 표현형을 정량적으로 측정하는 능력을 보여 준다. 우리는 돌연변이 (예를 들어, dscam1-/-)와 비교하여 야생 유형에서 덴드 라이트 팁의 총 수를 계산했습니다.
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토론
신경 형태학을 공부하기위한 염료 라벨링의 사용은 유전 세포 라벨링 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 라벨링 기술은 운동 뉴런의 형태에 라벨링 및 이미징에 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 염료 라벨링 과정은 2 시간 미만이 걸리고 뉴런 돌기의 윤곽을 정의 할 수 있기 때문에 매우 빠릅니다. 대안으로, aCC에서 효모 GAL4 전사 인자를 발현하는 GAL4 라인을 선택하고, 상류 활성화 서열(UAS)에 의해 조절되는 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터와 교차하여 aCC 모터 뉴런을 가시화할 수있다(21). GFP 라벨링 기술은 유전적 십자가를 필요로 하므로 며칠이 더 걸립니다.
염료 라벨링의 또 다른 장점은 매우 높은 밀도로 플라즈마 멤브레인의 라벨링을 허용하는 것입니다. 친유성 염료의 충분한 밀도는 우리가 표지된 구조물의 세부사항을 해결하는 것을 허용하는 막의 모든 부분에 존재할 수 있습니다. 대조적으로, GFP 분자의 밀도.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
원고에 대한 의견에 대해 가미야마 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 NS107558(M.I., K.B., D.K.)에 의해 지원되었습니다.
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재료
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| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI ThermoFisher | V22888 | ||
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| 해부 현미경 | 니콘 | N/A | SMZ-U |
| 양면 테이프 | 스카치 | 665 | |
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참고문헌
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new te....
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