유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
오르가노이드는 접시의 편리함으로 생리적 과정을 재연하는 자가 조직, 3차원 조직 구조를 제공합니다. 뮤린 유방 동맥은 두 개의 별개의 상피 세포 구획으로 구성되어 있으며, 외부, 수축성 근상피 구획 및 내부, 분비 발광 구획과 같은 서로 다른 기능을 제공합니다. 여기에서, 우리는 이 구획을 포함하는 세포가 유방 선 형태 형성 및 분화에 그들의 개별 적인 혈통 기여를 조사하기 위하여 단리되고 그 때 결합되는 방법을 기술합니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 형광 활성화 세포 선별과 같은 정교한 분리 기술이 필요하지 않습니다. 대신, 우리는 조직을 수확하고 효소적으로 소화하고, 부착 조직 배양 접시에 상피를 씨를 뿌린 다음 차동 트립시니화를 사용하여 ~ 90 % 순도의 발광 세포에서 근상추신을 분리합니다. 세포는 그 때 배양에 있는 10 일 후에 우유를 생성하기 위하여 분화될 수 있는 이중층, 3차원 (3D) organoids로 조직되는 세포외 매트릭스에서 그 때 도금됩니다. 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여는, 세포는 야생 모형 또는 유전으로 조작한 마우스 모형에서 수확될 수 있습니다, 또는 3D 문화 전에 유전으로 조작될 수 있습니다. 이 기술은 발광 또는 근상피 구획에서 특히 유전자 기능의 조사를 허용하는 모자이크 오르가노이드를 생성하는 데 사용될 수 있습니다.
서론
유방 선 (MG)는 지방세포가 풍부한 기질 안에 내장 된 나무 와 같은 관 상피 구조입니다. 이중층 덕트 상피는 수축성, 근상피세포(MyoECs) 및 중추세포의 내층, 분비상피세포(LEC)의 외부, 기저층을 포함하며, 중앙 루멘1을둘러싸고 있다. 외부 MyoECs 내부 폐포 LECs에서 우유를 짜내기 위해 계약 하는 동안 수 유 하는 동안, MG 성장 인자 (예를 들어, EGF 와 FGF) 그리고 호르몬 (예를 들어, 프로게스테론, 인슐린, 그리고 prolactin)의 통제 하에 수많은 변화를 겪는다. 이러한 변화는 수유 중 우유를 합성하고 분비하는 특수 구조인 폐포의 분화를 유발합니다1. 유방 상피계는 실험적으로 상피 조직 단편, 세포, 또는 단일 기저 세포가 숙주 유방 지방 패드로 이식되는 기술을 사용하여 조작될 수 있으며, 내인성 유방 parenchyma의 사전 제거, 전체, 기능상피트리2,,3,,4,,5를재구성하기 위해 성장하도록 허용된다. 이식은 강력한 기술이지만, 돌연변이가 초기 배아 치사(E14 이전)를 초래하여 이식 가능한 유방 조개 배의 구조를 방해하는 경우 시간이 많이 걸리고 불가능합니다. 게다가, 조사자는 수시로 계보 제한한 전구 세포에서 파생되는 2개의 다른 구획의 역할을 연구하고 싶습니다. Cre-lox 기술은 MyoECs및 LEC의 차등 유전자 조작을 허용하지만, 이것은 또한 시간과 비용이 많이 드는 사업입니다. 따라서, 1950년대 이후, 조사자들은 유선 조직 구조 및 기능에 관한 질문을 비교적 쉽고 효율적으로 해결하는 방법으로 시험관내 유방 유기체를사용해 왔으며6,7.
1차 유방 상피 세포의 분리 및 배양을 설명하는 초기 프로토콜에서, 연구자들은 플라즈마 혈전과 닭 배아 추출물로 구성된 지하 막 매트릭스(BME)가 접시에서 자란 MG 단편에 필요하다는 것을발견하였다 6. 다음 십년간에서, 세포외 매트릭스(Engelbreth-Holm-Swarm murine 육종 세포에 의해 분비된 EMS, 콜라겐 및 젤리같은 단백질 매트릭스)는 3D 배양을 촉진하고 생체 내 환경7,,8,,9,,10을더 잘 모방하기 위해 개발되었다. 3D 행렬에서 세포를 배양하는 것은 생체 내 생리학적과정9,,10,,11,,12에서이러한 미세환경이 더 나은 모델이라는 여러 기준(형태학, 유전자 발현 및 호르몬 반응성)에 의해 밝혀졌다. 1차 뮤린 세포를 이용한 연구는 오르가노이드의 확장된 유지 및 분화에 필요한 주요 성장 인자 및 모르포겐을확인하였다 13. 이러한 연구는 여기에 제시된 프로토콜에 대한 무대를 설정하고, 인간 유방 세포의 배양을 3D 오르가노이드로, 이는 현재 현대 임상 도구이며, 환자 샘플에 대한 약물 발견 및 약물 검사를 허용한다14. 전반적으로, 오르가노이드 배양은 1 차적인 세포의 자기 조직 수용량 및 형태 형성과 분화에 그들의 기여를 강조합니다.
여기서 제시된 것은 우유 생성 아시니로 분화될 수 있는 배양 뮤린 상피에 대한 프로토콜이다. 차동 트립시네화 기술은 2개의 별개의 MG 세포 구획을 구성하는 MyoECs 및 LECs를 격리하기 위하여 이용됩니다. 이 분리된 세포 분획은 그 때 유전자 기능을 과발현하거나 녹다운하기 위하여 유전으로 조작될 수 있습니다. 계보-내재성, 자기 조직은 유방 상피 세포의 타고난 속성이기 때문에15,,16,,17,이러한 세포 분획을 재조합하면 연구자들은 이중층, 모자이크 오르가노이드를 생성할 수 있다. 우리는 효소적으로 지방 조직을 소화하고 24 시간 동안 조직 배양 접시에 유방 조각을 배양하는 것으로 시작합니다(그림 1). 조직 단편은 생체 내 조직과 이중 층 조각으로 폴리스티렌 접시에 정착 : 내부 발광 층을 둘러싼 외부 근상피층 층. 이러한 세포 조직은 트립신-EDTA(0.05%)에 의한 외부 MyoECs의 격리를 허용합니다. 3-6분 동안 트립신-EDTA 2라운드(0.05%) 남은 내부 LES를 분리하는치료(그림 2). 따라서, 상이한 트립신 감도를 가진 이들 세포 유형은 단리되고 이후에 ECM에서 혼합 및 도금될 수있다(도 3). 세포는 내부 LEC를 둘러싼 MyoECs의 외부 층을 포함하는 이중 층구를 형성하기 위하여 자기 조직을 겪습니다. 루멘 형성은 세포가 성장 인자의 칵테일을 포함하는 배지에서 성장함에 따라 발생 (성장 매체에 대한 조리법 참조)13. 5일 후, 오르가노이드는 알베올로제네시스 배지(레시피 및 도 3F참조)로 전환하여 우유 생산 아시니로 분화하고 또 다른 5일 동안 배양할 수 있다. 대안적으로, 오르가노이드는 적어도 10일 동안 성장 배지에서 계속 확장및 분기될 것이다. 오르가노이드는 면역형광(도3D-F)을이용하여 분석하거나 회복용액을 사용하여 ECM으로부터 방출될 수 있다(물질표참조)하고 다른 방법들(예를 들어, 면역블롯, RT-qPCR)을 통해 분석될 수 있다.
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1일차: 유선 소화
- 성숙한 암컷 마우스로부터 10-14주령의 MGs를 수확할 준비를 한다.
- 무균 조건하에서 열린 벤치에서 수확을 수행하십시오.
- 수술 전 20분 동안 70%의 알코올을 오토클레이브하고 담금으로써 모든 수술 용품, 코르크 보드 및 핀을 살균하십시오.
- 0.5 mL 인슐린 주사기로 복강 내 주사를 통해 전달되는 펜토바르비탈 나트륨(2X 마취용량 0.06 mg/g 체중)으로 동물을 마취시다.
- 동물의 발가락을 꼬집어 반사 반응을 확인하고 동물이 완전히 마취 된 후에만 프로토콜을 시작하여 마취 수준을 모니터링하십시오.
- 동물을 등에 대고 부속물을 코르크보드에 고정하고 복부와 가슴을 에탄올로 닦아냅니다.
- #2, 3, 4, 및 5개의 MG를 하나의 마우스로부터 수확하기 위해(즉, 8개의 MGs, 도 1A)두 뒷다리 사이의 중간선을 식별하고 날카로운 가위로 복부 피부에 작은 절개(1cm)를 한 다음,목(18)까지컷을 확장한다.
- 면봉을 사용하여 피부가 방출 될 수 있도록 다리와 팔을 향해 작은 컷을 만들어 따릅니다. 피부를 멀리 당기고 한쪽에 고정하기 전에 단단히 스트레칭(그림 1B,1 단계 1)18. 그 아래에 절단하여 MGs를 제거하고, #4 땀샘에서 림프절을 제거(그림 1B,단계 2, 3)18. 신체의 반대편에서 절차를 반복합니다.
- MG 조직을 4°C Dulbecco의 변형 된 독수리 의 매체 (DMEM)/영양 혼합물 F12 (F12)에서 5 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1X 항생제 항균제(Anti-Anti)18로채취하십시오.
- 35mm 접시나 면도날 이나 티슈 다기를 사용하여 세라믹 접시에 땀샘을 잘라. 티슈 조각이 1 mL 마이크로 파이펫 팁을 쉽게 통과 할 수 될 때까지 5 개의 수동 갈비 또는 조직 헬기의 모든 라운드를 돌립니다 (~ 0.1 mm / 조각, 그림 1C).
- 소화 배지에서 MGs를 소화(표 1참조)에서 14시간 동안 37°C, 5%CO2에서6개의 잘 낮은 접착 접시에.
2. 일 2: 유방 상피 조직 단편의 격리
- 소화 14 시간 후, 1 mL 마이크로 파이펫을 사용하여 소화 된 조직을 10X로 부드럽게 섞어서 남아있는 기질 이나 지방 조직을 분해하여 거품이나 과도한 기계적 힘이 생성되지 않도록합니다.
참고 : 14 시간 후에 불완전한 소화가 있는 경우에, 이것은 전형DNA의 축적 때문일 수 있었습니다. 이 경우 소화 배지 2 mL당 1 mg/mL 데옥시리보누클리스 I(DNase I)의 1 μL을 추가합니다. 37 °C, 5%CO2에서또 다른 30 분 동안 배양하십시오. - 15 mL 튜브에서 조직을 수집하고 조직 배양 등급 1X 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)의 2-3 mL로 소화에 사용되는 잘 헹구고 Ca2 + 및 Mg2 +무료. 원심분리기는 600 x g에서 10분 간.
- 지질 층 및 배지를 포함하는 상급물질을 배출한 다음, DPBS의 5 mL에서 펠릿을 재중단하고 새로운 15 mL 튜브로 전환한다. 원심분리기는 600 x g에서 10분 간.
- 원심분리 동안 50 mL 튜브에 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 배치하고 37 °C DMEM / F12의 10 mL를 사용하여 스트레이너를 prewet.
- 프로토콜 단계 2.4에서 조직 단편을 5 mL의 DPBS를 사용하여 재중단하고 기질 세포 및 단일 세포를 제거하기 위해 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 전달합니다(도1D).
- 세포 스트레이너에 조직 단편을 수집합니다. 37°C DMEM/F12의 10 mL로 4X를 헹구는다(그림1D).
주의: 불완전한 헹구는 것은 비상피 세포로 오염된 배양물로 귀착될 것입니다. - 글로브핑기 탭을 장갑을 낀 손가락으로 잡고, 60 mm 조직 배양 접시 위에 스트레이너를 반전시키고 유지 보수 배지의 1 mL aliquots를 통과하여 조직 단편을 해제 (그림 1E)의 바닥을 통해 유지 보수 매체의 1 mL aliquots를 통과한다(도1E).
- 육안으로 볼 수 있는 조직 단편 잔재에 대한 여과기를 확인하고, 어떤 파편이 여전히 여과기에 준수되는 경우 유지 보수 매체의 1 mL로 스트레이너 1 배 더 헹구는다. 헹구는 조직 단편은 이제 기질 세포가 없어야합니다.
- 반전된 현미경(4X 또는 10X 목표, 도 1F)에서프로토콜 단계 2.9로부터 MG 단편을 함유하는 60 mm 접시를 신속하게 검사한다. 8개의 MG의 전형적인 제제는 ~ 500개의 조각을 산출한다. 단일 세포 또는 지방 물방울에 대 한 보고 하 고 오염 된 세포가 있는지 여부.
참고: 오염 된 세포가있는 경우, 5 mL 파이펫을 사용하여 60mm 접시에서 배지 및 파편을 수집하고 신선한 70 μm 스트레이너를 통해 조각을 다시 필터링하여 여과 단계를 반복하여 프로토콜 단계 2.6, 2.8-2.10을 반복합니다. - 37°C에서 24h, 5%CO2에서배양하고, 조직 단편이 이중층 단편을 부착하고 생성할 수 있도록한다(도 2A).
참고 : 조각이 24 시간까지 정착되지 않은 경우 부착 될 때까지 계속 배양하십시오. 파편이 잘 부착되지 않으면 셀 구획의 분리가 작동하지 않습니다. 연구원이 유착에 대해 우려하는 경우, 조직 배양 판은 단편 부착을 촉진하기 위해 치료될 수 있다(예를 들어, 폴리-L-리신).
3. 일 3: 근상피 및 발광 상피 세포의 차동 시도
- LES에서 MyoE를 분리하려면 접시에서 미디어를 비우고 DPBS 1 mL로 1 x를 헹구고 신선한 트립신 EDTA 1 mL (0.05 %)를 추가하고 반전 된 현미경 (10X 또는 20X 목표, 그림 2B,C,F)에서소화를 주의 깊게 모니터링하십시오. 외부 MyoEC 층의 분리는 트립신-EDTA (0.05%)에 따라 3-6 분이 필요합니다. 강도.
참고: 이 프로세스를 보여주는 대표 이미지는 그림 2를 참조하십시오. 밝은 필드 조명 에서 MyoECs는 둥글게 나타나고 중앙에 부착된 상태로 유지되고 더 어둡게 나타나는 LEC에 비해 더 밝은 모양을 갖습니다. - 2 mL 10% FBS/DPBS를 포함하는 15 mL 튜브에서 MyoEC 분획을 수집합니다. LES를 방해하지 않고 DPBS 2 mL로 60mm 접시를 부드럽게 헹구고 DPBS(그림 2H-I)를폐기하십시오.
참고: MyoECs의 일반적인 복구는 MG의 크기에 따라 범위(3.5 x 106-1.5 x 106)내에 있습니다. - LEC 분획을 제거하려면 트립신-EDTA 1mL(0.05%)를 추가합니다. 다시 접시에 7-15 분 배양, 과소화를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링. 트립신-EDTA (0.05%) 10 % FBS / DPBS의 2 mL로 접시에. 새로운 15 mL 튜브에서 LEC 분획을 수집합니다.
참고: LEC에 대한 일반적인 회복은 MGs의 크기에 따라 범위(2 x 10Figure 2E6-4.2 x 106)내에 있습니다.619 - 트립신-EDTA(0.05%)를 제거하기 위해 300 x g에서 5분 동안 각 분획을 원심분리기. 펠릿을 유지 보수 배지의 250 μL에서 다시 중단하고 혈세포 계측계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 각 세포 집단을 계산합니다. 셀을 계산하는 동안 얼음 위에 놓습니다.
참고 : 세포 분획의 유전 적 조작이 필요한 경우, 기본 세포는 낮은 접착 접시에 성장하고 렌티 바이러스(20)에감염 될 수있다.
4. 3일차: 세포외 기질에 세포 분획을 결합하고 포함
참고: MyoEC 및 LEC 분획을 수집하고 계산하면 결합할 수 있습니다. 일반적인 MyoEC/LEC 비율은 1:3(그림 3A)19입니다. 다른 연구가 수행 될 수있다. 예를 들어, 모자이크 연구를 수행하기 위해, 분획은 야생 형 (WT) 및 돌연변이 (돌연변이) 마우스에서 생성될 수 있고 결합 (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/음소거; 음소거/WT; 음소거/음소거)21,또는 분획은 MyoECs/LECs19의서로 다른 비율을 사용하여 결합될 수 있다.
- 셀 수에 따라 12,000개의 셀/웰(예: 3,000 MyoECs:9,000 LEC)에 대해 준비해야 하는 웰(8개의 웰 챔버, 재료 표참조)의 수를 계산합니다.
- 50% ECM(페놀 적색이 없는 50% ECM/50% DMEM/F12)의 90 μL을 추가하여 Table of Materials3D 배양에 대한 기본 층을 확립합니다. 거품이 없고 우물이 고르게 코팅되었는지 확인하십시오. 염기층을 고형화하기 위해 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 배양합니다.
참고 : ECM은이 단계까지 얼음 추위를 유지해야합니다, 그렇지 않으면 조기에 중합하고 고르지 않은 기본 코팅 및 중합으로 이어질 것입니다. 기본 ECM을 사용하면 단일 평면에서 오르가노이드 성장이 향상되어 이미지 캡처에 도움이 됩니다. 이것은 또한 더 빠른 오르가노이드 성장을 얻고 더 적은 ECM22를이용합니다. - 중합 하는 동안, 셀 믹스를 준비 합니다. 300 x g에서 5분 동안 MyoEC 및 LEC 분획을 펠렛하고 각 세포 분획을 10% ECM/90% 성장 배지에서 다시 일시 중단하여 각 웰이 100 μL을 가지도록 합니다(성장 배지를 만드는 방법에 대한 표 1 참조).
참고: 준비의 용이성을 위해 동일한 셀 믹스를 사용하여 우물을 복제하십시오. 이들은 하나의 튜브에서 결합및 제조될 수 있다(예를 들어, 동일한 세포 혼합물의 4개의 웰이 10% ECM/90% 성장 배지의 400 μL에서 제조될 수 있다). - 각 세포 혼합물의 100 μL을 각 우물에 10% ECM/90% 성장 배지에 넣고 오르가노이드가 37°C, 5%CO2에서20분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
- 세포가 정착되면, 각 우물의 챔버 벽을 부드럽게 피펫팅하여 성장 매체의 100 μL을 부드럽게 추가하십시오. 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 배양합니다(각 웰의 총 조성에 대한 도 3A 참조).
참고: 로키나제 억제제, R-spondin 및 Nrg1은 1차 뮤린 유방 세포 및 인간 유방암 세포 둘 다에서 성장한 오르가노이드의 장기 배양에 중요한 것으로 확인된 인자이다13,,14. 또한, 줄기세포 인자 B27 및 N2는 오르가노이드가 배양될 수 있는 시간을 연장한다. - 이미지 세포는 24시간마다 그들의 성장을 추적하고 100 μL/well을 사용하여 2-3일마다 성장 배지를 부드럽게 갱신한다(그림3B-E).
참고: 매체를 갱신할 때는 각별한 주의를 기울이세요. 챔버 슬라이드를 기울여 우물의 한 쪽 구석에 있는 매체를 수집합니다. 배지의 ≤100 μL을 제거하고 ECM 층을 방해받지 않도록 주의하여 보충하십시오. - 연구자들이 수유/알베올로제네시스 조사에 관심이 있다면, 5일째에 알베올로제네시스 배지(표 1참조)로 전환하고 10일(도3F)또는 그 이후에도 매 2-3일마다 배지를 계속 갱신한다(자료표 참조)13.Figure 3 Table of Materials
참고: 이 시점에서, 오르가노이드는 4°C 회수 용액의 400 μL에서 4°C에서 4°C로 배양함으로써 ECM으로부터 분리될 수 있다(프로토콜 및 시약 정보에 대한 재료 표 참조).
5. 5일 차 또는 10일: 고정 및 면역 염색 오르가노이드
- 매체를 부드럽게 파이펫팅하여 매체를 조심스럽게 제거하십시오 (전구 파이펫이 가장 잘 작동합니다). 1x 덜베코의 인산완충 식염수 200 μL을 사용하여 각 잘 헹구세요 (DPBS, 레시피 참조).
- 실온에서 10 분 동안 감기 (4 °C) 4 % (w / v) 파라 포름 알데히드 (PFA, 조리법 참조)를 사용하여 오르가노이드를 고정하십시오.
주의: PFA는 위험합니다. 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 안전 안경)를 착용하십시오. 이 단계는 연기 후드 내부에서 수행해야합니다.
참고: ECM은 PFA 처리에 의해 용해됩니다. 불완전한 ECM 제거는 오르가노이드가 면역 형광에 의해 분석될 때 배경 염색으로 이끌어 낼 수 있습니다. - 4% PFA를 제거하고 글리신/DPBS 0.2%(v)의 200 μL을 Table 1각각 잘 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 또는 4°C로 밤새 인큐베이션하여 느린 설정으로 설정된 흔들 표면에서.
참고: 오르가노이드는 다음 단계 이전에 4°C에서 DPBS에서 1-3일 동안 보관할 수 있다. - DPBS + 0.25% 트리톤 X-100 (PBST, 표 1참조)을 사용하여 실온에서 10 분 동안 오르가노이드를 투과화.
- 흔들리는 표면에 1 시간 동안 DPBS에서 5 % 당나귀 혈청 (DS) (또는 이차 항체의 종과 일치하는 다른 혈청)을 사용하여 오르가노이드를 차단합니다.
참고: 이 단계는 흔들 표면에서 4°C에서 하룻밤 동안 수행될 수 있다. - 1% DS/DPBS에 1차 항체를 준비합니다. 각 우물에 125-200 μL을 사용하십시오. 흔들 표면에서 4°C에서 1차 항체에서 하룻밤 동안 오르가노이드를 배양하여 면역 염색을 수행합니다.
6. 11일: 완전한 면역형광
- 200 μL PBST로 2X를 5분 동안 세척하십시오. 1% DS/DPBS에 이차 항체를 각 웰당 125-200 μL을 사용하여 추가하십시오. 45 분 동안 흔들 표면에 실온에서 배양.
- 웰 당 200 μL PBST를 사용하여 각 우물 2X를 세척하십시오.
- DPBS에서 Hoechst DNA 염료를 사용하여 핵을 염색하십시오 (DPBS에서 1:2,000)를 실온에서 5 분 동안.
- 진공으로 부드럽게 흡입하여 우물에 남은 모든 액체를 제거합니다.
- 조심스럽게 챔버와 개스킷을 제거하고, 장착 매체 (재료 표참조)의 한 방울 (~30 μL)을 각 우물에 놓고 뚜껑슬립을 제거하고 거품을 제거하십시오. 슬라이드가 어두운 공간에서 1-2일 동안 건조되도록 합니다. 클리어 매니큐어로 밀봉합니다. 공초점 현미경상에서 오르가노이드를 이미지화하였다(그림3E-F).
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결과
여기에 제시된 프로토콜은 모자이크 오르가노이드를 이용하여 유방 상피 세포의 특정 혈통 기여를 조사하는 방법을 설명합니다. 오르가노이드에 대한 1 차적인 뮤린 세포를 얻으려면 유방 선 상피가 먼저 주변 지방세포 풍부 기질로부터 분리되어야합니다(그림 1). 이 과정은 여기에 간략하게 설명되며 또한 이전에 발표된 연구18에기재되어 있다. 충분한 세포를 얻으려면 #2, 3, 4 및 5 MG를 제거하는 것이 좋습니다(그림 1A). 상피 세포의 순수한 집단을 분리하는 중요한 단계 열쇠는 준비를 오염시킬 면역 세포가 풍부한 #4 MGs에서 림프절의 제거입니다(그림 1A,B). MGs를 다진 후 크기 ~0.1 mm 크기의 조...
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토론
여기에서, 연구원은 1 차적인 MG 세포를 사용하여 3D organoid 문화를 생성할 수 있는 방법을 상세히 제시됩니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 차이점은 두 개의 별개의 MG 세포 구획인 외부 기저 MyoECs 및 내부 LEC를 분리하는 방법을 자세히 설명한다는 것입니다. 우리의 방법은 2 단계 트립신 EDTA (0.05 %)를 채택 우리가 차등 트립시니화 라고 하는 치료19. 이 절차는 연구원이 정교한 유동 세포 측정을 사용하지 않고 MyoECs 및 LEC를 분리할 수 있게 해주며, 따라서 FACS에 필요한 잘 특성화된 바이오마커가 없을 수 있는 다양한 포유류 종에서 수확된 MGs를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 두 세포 하위 집단을 분리하는 능력은 연구원이 유전으로 분리된 세포를 독립적으로 수정하거나 유전 돌연변이 또는 라벨을 품고 있는 동물에게서 세포를 재결합하고, 따라서 3D 문화에서 모자이크 오르가노이드를 생성하는 것을 가능하게 합니다. 현재 프로토콜의 한계는 기질...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 캘리포니아 대학에서 기술 지원 및 핵심 지원을 벤 아브람스 감사합니다, 산타 크루즈 (UCSC) 줄기 세포의 생물학 연구소 (IBSC). 우리는 그들의 솔라미어 회전 디스크 공초점 현미경의 사용에 대한 수잔 스트롬과 빌 색스턴 감사합니다. 이 작품은 고등 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 UCSC에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (S.R.), NIH에서 (NIH GM058903) 학생 개발을 극대화하기위한 이니셔티브에 대한 (H.M.) 대학원 연구 펠로우십 (O.C. DGE 1339067)과 UC-암 연구 조정위원회 (LH)의 보조금 (A18-0370)에 의해 국립 과학 재단.
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재료
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| 50ml 고선명도 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD Falcon) | Fisher Scientific | ||
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| 70 µ M 나일론 세포 여과기 (코닝) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
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| B6 ACTb-EGFP 마우스 | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD 인슐린 주사기 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | 사용 지침을 따르십시오. 코닝에서 3차원 구조 추출 코닝 마트리겔 매트릭스 |
| 코닝 코스타 초저 부착물 6웰 | 피셔 사이언티픽 | CLS3471 | |
| 덱사메타손 | 밀리포어 시그마 | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| 당나귀 안티 염소 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | 1:500에 사용, 로트: 1608641, 재고 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| 당나귀 안티 마우스 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | 1:1000에 사용, 로트: 140554, 재고 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| 태아 소 혈청 | VWR | 97068– 085 | 100% 미국 원산지, 프리미엄 등급, 로트: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | 텍스트의 마운팅 미디어로 언급 |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | 1:250에서 사용, 로트: J1011, 재고 200 &마이크로; g/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | 사용 1:2000, 재고는 20mM |
| 인슐린 | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14– CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel 성장 인자 감소(GFR); 페놀 레드 프리; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | 로트: 8204010, 재고 농도 8.9 mg/mL |
| MillexGV 필터 유닛 0.22 &마이크로; m | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8웰 유리, 멸균 | Millipore Sigma | PEZGS0816 | 이 챔버 슬라이드는 개스킷 제거에 적합하지만 다른 브랜드(예: Lab Tek II)도 잘 작동할 수 있습니다. |
| 마우스 anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | 1:500에 사용, 로트: 128M4881V, 재고 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 보충제(100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R& D | 5898-NR-050 | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho 억제제 Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| 수산화나트륨 | Fisher Scientific | S318-500 | |
| 멸균 여과 당나귀 혈청 | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| 멸균 여과 당나귀 혈청 | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| 트리톤 X-100 | 밀리포어 시그마 | x100-500ML | 실험실 등급 |
| 트립신 EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
참고문헌
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