이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 기능의 평가

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60751

⸱

2020년 6월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

이 논문에서

요약

이 문서는 필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 손상을 평가하기 위한 실험적인 절차를 제출합니다. 이 프로토콜은 간질에 있는 일반적인 comorbidities의 한개인 간질 관련한 인식 쇠퇴의 병리생리학 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

초록

인지 장애는 측두엽 간질에서 가장 흔한 동반기능 중 하나입니다. 간질의 동물 모델에서 간질 관련 인지 감소를 재현하기 위해, 우리는 필로카핀 처리 만성 간질 마우스를 생성했다. 우리는 이 간질 마우스를 사용하여 3개의 다른 행동 시험을 위한 프로토콜을 제시합니다: 새로운 객체 위치 (NL), 새로운 객체 인식 (NO), 및 패턴 분리 (PS) 시험은 장소, 객체 및 문맥에 대한 학습 및 기억을 각각 평가하기 위하여. 우리는 동물의 기저 운동 활동을 측정하는 개방 필드 테스트에 따라 행동 장치를 설정하고 NL, NO 및 PS 테스트에 대한 실험 절차를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 간질 마우스에 있는 기억 기능을 평가하기 위한 그밖 행동 시험에 관하여 NL, NO 및 PS 시험의 기술적인 이점을 기술합니다. 마지막으로, 우리는 성공적인 메모리 테스트를위한 중요한 단계인 친숙한 세션 동안 개체와 30 초의 좋은 접촉을하지 못하는 간질 마우스에 대한 가능한 원인과 해결책을 논의합니다. 따라서, 이 프로토콜은 마우스를 사용하여 간질 관련 기억 손상을 평가하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공합니다. NL, NO 및 PS 시험은 간질 마우스에 있는 기억의 다른 종류의 평가에 적합한 간단하고 능률적인 분석입니다.

서론

간질은 자발적인 재발성발작을특징으로 하는 만성질환1,2,,3. 반복적 인 발작은 뇌의 구조적 및 기능적 이상을 일으킬 수 있기 때문에1,,2,,3,비정상적인 발작 활동은 가장 흔한 간질 관련 동반 작용 중 하나인 인지 기능 장애에 기여할 수 있습니다4,,5,,6. 일시적이고 일시적인 만성 발작 사건과는 달리, 인지 장애는 간질 환자의 삶 전반에 걸쳐 지속될 수 있으며 삶의 질을 악화시킬 수 있습니다. 따라서 간질과 관련된 인지 기능 저하의 병리 생리학적 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다.

간질의 다양한 실험 동물 모델은 만성 간질7,8,89,10,,9,11,,12와관련된 학습 및 기억 결핍을 입증하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 모리스 물 미로, 상황별 공포 컨디셔닝, 홀 보드, 새로운 개체 위치 (NL), 및 새로운 개체 인식 (NO) 테스트는 자주 측두엽 간질에서 메모리 기능 장애를 평가하는 데 사용되었습니다 (TLE). 해마는 TLE가 병리학을 보여주는 1 차적인 지구의 한개이기 때문에, 해마 의존적인 기억 기능을 평가할 수 있는 행동 시험은 수시로 우선적으로 선택됩니다. 그러나, 발작이 비정상적인 해마 신경 발생을 유도하고 간질 관련 인지 감소에 기여할 수 있다는 점을 감안할때,신생아 신경 기능 (즉, 공간 패턴 분리, PS)8,,13은 또한 간질에서 기억 장애의 세포 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.

이 문서에서는 간질 마우스에 대한 메모리 테스트, NL, NO 및 PS의 배터리를 보여 줍니다. 테스트는 간단하고 쉽게 접근할 수 있으며 정교한 시스템이 필요하지 않습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 실험 절차는 가톨릭대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 국립과학수사연구원의 실험실동물 관리 및 이용안내(NIH 간행물 제80-23호)에 따라 실시되었다.

1. 새로운 개체 위치 테스트 (NL)

  1. 간질 C57BL/6 또는 필로카핀 주사 후 4-6주 후에 형질전환 마우스를 준비하십시오.
    참고: 급성 발작은 복강 내(IP) 필로카핀 주사에 의해 유도되었고, 이전 보고서14에상세히 설명된 프로토콜에 따라.
  2. 행동 시험이 시작되기 하루 전에 사육실에서 행동 방으로 간질 마우스를 옮긴다. 마우스가 하룻밤 동안 적어도 12 시간 동안 습관화할 수 있도록 하십시오.
  3. 행동실에서 개별 마우스를 단일 하우징을 위한 새장으로 분리합니다. 케이지 카드에 각 동물에 대한 정보를 작성하고 행동 테스트 내내 동물을 동일한 케이지에 보관하십시오. 카트를 사용하여 여러 케이지를 동시에 전송할 수 있습니다.
  4. 다음날, 이른 아침에 3일간의 습관 세션(H1-H3)을 시작합니다. 동물을 홈 케이지의 저조도에 30분 이상 적응시킴.
  5. 44 x 44 x 31cm의 외부 치수와 43 x 43 x 30.5cm의 내부 치수로 열린 필드 상자를 준비합니다. 습관 (H1)의 첫 날에, 오픈 필드 상자의 중심에 조명계를 배치하고 60 럭스로 조도를 조정합니다.
  6. 70% 에탄올로 열린 필드 박스의 바닥과 벽에 스프레이하고 깨끗한 종이 타월로 닦아내면 가능한 후각 신호를 제거합니다. 그런 다음 잔류 알코올이 완전히 건조 될 때까지 적어도 1 분 동안 기다립니다.
  7. 오픈 필드 테스트를 수행하여 각 마우스의 운동 활동을 평가합니다.
    1. 각 실험 마우스의 동작을 기록하고 추적하려면 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어를 사용합니다(재료 표참조).
    2. 비디오 추적 소프트웨어가 열리면 열린 필드 상자의 크기를 보정합니다. 그런 다음 추적 영역을 설정합니다. 실험자의 손을 추적하지 않도록 3초의 대기 시간과 15분의 획득 시간을 설정합니다. 각 실험 마우스(그룹, 성별, 나이 등)에 대한 정보를 삽입합니다.
    3. 그런 다음 실험용 마우스를 벽을 향한 열린 필드 상자에 부드럽게 놓습니다. 케이지 뚜껑에 놓아 취급과 관련된 스트레스와 불안을 최소화하십시오. 그런 다음 친숙한 세션(1.9.3 단계)에서 개체가 있는 위치에서 가장 멀리 떨어진 열린 필드 상자의 벽 근처에서 마우스를 놓습니다.
      참고: 마우스가 열린 필드 상자에 있으면 마우스 추적 소프트웨어가 자동으로 마우스를 감지하고 녹화를 시작합니다. 최적의 탐색을 위해 카메라를 열린 필드 상자 바로 위에 배치할 수 있습니다.
    4. 15분 동안 녹음한 후 케이지 뚜껑에 놓아 동물을 홈 케이지로 되돌리시고 집으로 되돌리시고. 70% 에탄올 스프레이로 오픈 필드 박스를 청소하고 시험 사이에 깨끗한 종이 타월로 닦으소. 밝은 빛을 복원하고 제조업체의 지침에 따라 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 이동한 동물의 총 거리를 측정합니다.
      1. 비디오 추적 소프트웨어 및 비디오 클립을 엽니다. 그런 다음 해석을 클릭하여 열린 필드 상자 크기의 보정을 기반으로 이동된 총 거리를 계산합니다.
  8. 2일째와 3일째에, 1.3단계부터 1.7단계까지 반복하여 습관성 세션(H2, H3)을 수행한다.
  9. 4일째에는 익숙해지기 세션(F1)을 수행합니다.
    1. 희미한 빛에서 각 마우스를 빈 열린 필드에 3 분 동안 놓습니다. 그 짧은 재활 후, 홈 케이지에 동물을 반환합니다.
    2. 습관동안 70% 에탄올로 물건을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드 경기장에 동일한 두 개의 오브젝트(고무 인형, 오브젝트 A)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험용 마우스를 열린 필드 상자에 넣고 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향합니다.
    4. 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 마우스를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
    5. 동물을 열린 필드 박스에서 제거 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
  10. 5일째에는 NL 테스트 세션을 수행합니다.
    1. 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮김을 옮김. 그런 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
    2. 습관동안 70% 에탄올로 물건을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 인접한 벽에서 5cm 떨어진 대각선 위치로 한 오브젝트(고무 인형, 오브젝트 A)를 이동합니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드 영역으로 옮기고 열린 필드 상자의 벽을 향하게 놓습니다.
      참고: 특정 방향에 대한 잠재적인 선천적 기본 설정을 줄이기 위해 이동된 오브젝트의 위치를 균형을 맞습니다. 예를 들어, 실험 동물의 절반에 대한 친숙한 세션에서 선호하는 개체의 위치를 변경하고, 나머지 동물에 대해, 익숙하지 않은 객체를 친숙한 세션에서 이동한다.
    4. 비디오 추적 시스템으로 10분 동안 무료 탐색 및 녹화를 허용합니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 차별 비율을
      figure-protocol-1
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
    5. 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다. 3 일 (6-8 일) 동안 마우스가 음식과 물에 무료로 접근 할 수 있게하십시오.
    6. 동물이 열린 필드 박스에서 제거되면 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.

2. 새로운 개체 인식 테스트 (NO)

  1. 9일째에는 1.2-1.7단계를 반복하여 15분 동안 습관세션을 진행합니다.
  2. 10일째에는 익숙해지기 세션(F1)을 수행합니다.
    1. 희미한 조명에서 마우스를 빈 열린 필드에 3분 동안 놓습니다. 열린 필드 영역으로 마우스를 재활 한 후 일시적으로 홈 케이지로 돌아갑니다.
    2. 습관화 하는 동안, 철저 하 게 70% 에탄올으로 개체를 청소 하 고 종이 타월으로 닦아. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 동일한 오브젝트 2개(40mL의 물, 물체 B로 채워진 50mL 플라스틱 튜브)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
    4. 동물이 NO 시험에서 2개의 상이한 물체(40 mL의 물로 채워진 50 mL 플라스틱 튜브, 객체 B; 유리 코플린 항아리, 객체 C)에 노출됨에 따라, F1 세션 동안 객체의 균형을 맞추게 된다. 예를 들어, 두 개의 동일한 개체(유리 코플린 항아리, 오브젝트 C)를 그룹의 동물의 절반에 대해 제시한다.
    5. 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
    6. 동물을 열린 필드 박스에서 제거 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
  3. 다음 날(11일)에 NO 테스트 세션을 수행합니다.
    1. 홈 케이지에서 3 분 동안 재활을 위해 열린 필드로 마우스를 옮은 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
    2. 습관화 하는 동안, 철저 하 게 70% 에탄올으로 개체를 청소 하 고 종이 타월으로 닦아. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 한 물체(물 40mL, 물체 B로 채워진 50mL 플라스틱 튜브)를 인접한 벽에서 5cm 떨어진 다른 물체(유리 코플린 항아리, 물체 C)로 교체합니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드로 옮기고 벽을 향하도록 놓습니다. NO 테스트 중에 함께 제공되는 개체의 균형을 조정합니다. 예를 들어, 익숙해지는 세션 동안 두 개의 유리 코플린 항아리(object C)에 노출된 마우스에 대해 40 mL의 물(개체 B)으로 채워진 50 mL 플라스틱 튜브로 하나의 유리 코플린 항아리(object C)를 교체한다.
      참고: 특정 방향에 대한 잠재적인 선천적 기본 설정을 줄이기 위해 대체된 개체의 위치를 균형을 맞출 수도 있습니다. 예를 들어, 두 개체(개체 B 또는 오브젝트 C)의 세트에 노출된 동물의 각 코호트에 대해, 실험 동물의 절반에 대한 친숙한 세션에서 바람직한 객체를 변경하고, 나머지 동물에 대해, 익숙해진 세션에서 덜 선호되는 객체를 대체한다.
    4. 10분 동안 무료 탐색을 허용하고 비디오 추적 시스템을 사용하여 녹화합니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 판별 비율을 계산합니다.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
    5. 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다. 3 일 (일 12-14) 동안, 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 마우스를 휴식하게하십시오.
    6. 동물이 열린 필드 상자에서 제거되면, 70 % 에탄올 스프레이로 열린 필드 박스의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다.

3. 패턴 분리 테스트 (PS)

  1. 15일째에 PS 시험을 위한 첫 번째 친숙화 세션(F1)을 수행합니다.
    1. 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 홈 케이지로 되돌아갑니다.
    2. 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 바닥 판(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)을 넓은 격자(5.5 x 5.5 cm)로 열린 필드 상자에 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 동일한 개체 두 개(50mL의 물, 물체 D로 채워진 플라스틱 T-플라스크)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
    4. 동물이 PS 테스트에서 두 개의 상이한 물체(50 mL의 물, 물체 D; 유리 병, 물체 E로 채워진 플라스틱 T-플라스크)에 노출됨에 따라, F1 및 F2 세션 동안 객체의 균형을 맞추게 된다. 예를 들어, 그룹의 동물 절반에 대해 와이드 그리드 바닥에 두 개의 동일한 오브젝트(유리 병, 오브젝트 E)를 제시한다.
    5. 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간 합계(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
    6. 첫 번째 익숙해지기 세션 (F1)을 완료 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 물체와 바닥 판을 철저히 청소하고 열린 필드 상자에서 제거하십시오.
  2. 다음날(16일)에 PS 시험을 위한 두 번째 친숙한 세션(F2)을 수행한다.
    1. 홈 케이지에서 3 분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
    2. 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 바닥 판(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)을 좁은 격자(2.75 x 2.75 cm)로 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 두 개의 동일한 물체(유리 병, 개체 E)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
    4. 카운터밸런싱을 위해 좁은 그리드 바닥에 두 개의 동일한 오브젝트(50mL의 물로 채워진 플라스틱 T-플라스크, 오브젝트 D)를 표시합니다.
    5. 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간 합계(30초)에 도달하면 F2 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
    6. 두 번째 익숙해지기 세션(F2)을 완료한 후 70% 에탄올 스프레이로 물체와 바닥판을 철저히 청소하고 열린 필드 박스에서 제거합니다.
  3. 다음 날(17일)에 PS 테스트 세션을 수행합니다.
    1. 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 홈 케이지로 되돌아갑니다.
    2. 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
    3. 좁은 격자(2.75 x 2.75 cm)를 열린 필드 상자에 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 바닥 판에 두 개의 다른 물체(물 50mL, 개체 D; 유리 병, 물체 E)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드 영역으로 옮기고 벽을 향하게 합니다.
    4. PS 테스트 중에 함께 제공되는 개체의 균형을 조정합니다. 예를 들어 각 오브젝트(오브젝트 D, 오브젝트 E)를 좁은 그리드 바닥에 배치하여 오브젝트 E를 이 컨텍스트에서 새로운 객체로 만듭니다. 객체 D 또는 오브젝트 E(좁은 바닥 패턴의 새로운 객체)의 위치를 균형을 맞추면 특정 방향에 대한 선천적 선호도의 가능성을 줄이기 위해 수행할 수도 있습니다. 예를 들어, 실험 동물의 절반에 대해 제2 친숙한 세션에서 바람직한 객체를 대체하고, 나머지 동물에 대해, 제2 친숙한 세션에서 덜 선호되는 객체를 대체한다.
    5. 비디오 추적 시스템을 사용하여 10분 동안 무료로 탐색하고 녹화할 수 있습니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 판별 비율을 계산합니다.
      참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
    6. 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다.

4. 크레실 바이올렛 염색

  1. 모든 행동 테스트를 완료 한 후, 케타민 (50 mg / mL)과 자일라진 (23.3 mg / mL)의 칵테일 (4:0.5)을 주입하여 동물을 마취110 mL / kg 체중 (IP; 1 mL 주사기; 26 G 바늘)의 용량으로 식염수에 용해. 발가락 핀치에 대한 반응이 없어 마취의 깊이를 확인하십시오.
  2. 일단 동물이 깊이 마취되면, 뇌를 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드와 트랜스 카피 잉류를 수행15.
  3. 트랜스카이어퍼우전이 끝나면 가위15로동물을 참수한다. 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 두개골을 제거하여 뇌를 노출시하십시오. 뇌가 분리 된 후, 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 그것을 후착, 0.01 M 인산완충 식염수에 30 % 자당에 냉동 보호 다음.
  4. 저온 극저온을 사용하여 스냅 냉동 뇌에서 관상 섹션 (30 μm)을 만듭니다.
  5. 슬라이드에 뇌 조직을 장착하고 100 % 에탄올에서 수돗물로 수돗물에 일련의 수화 단계를 수행하여 100 %, 95 %, 95 %, 80 %, 70 % 에탄올로 순차적으로 세척하십시오.
  6. 조직 슬라이드를 0.1% 크레실 바이올렛 용액으로 15 분 동안 배양합니다.
  7. 95% 에탄올/0.1% 빙하 아세트산에 티슈 슬라이드를 침지하여 과도한 얼룩을 제거한 다음 100% 에탄올, 50% 에탄올/50% 자일렌, 100% 자일렌용액으로 조직을 탈수합니다.
  8. 시판되는 자일렌 장착 매체를 사용하여 티슈 슬라이드를 덮어.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

인지 기능 평가를 위한 일반적인 실험 일정 및 설정은 그림 1에나와 있습니다. 필로카핀-유도 급성 발작의 도입 6주 후, 마우스는 시험 사이의 3일 휴식 기간에 의해 분리된 순서로 NL, NO 및 PS 시험을 실시하였다(도1A). NL 테스트의 경우 친숙한 세션(F1) 동안 두 개의 동일한 개체가 열린 필드에 배치되었고 다음 날 한 개체가 새 위치로 이동되었습니다. NO 테스트에서 테스트 세션 중에 하나의 개체가 새 개체로 대체되었습니다. PS 테스트의 경우 두 개의 친숙한 세션(F1, F2)은 서로 다른 바닥 그리드 패턴과 개체의 조합을 도입했습니다. 이어서, 시험 당일, 각 친숙한 세션의 하나의 객체를 좁은 격자 바닥 패턴에 배치하고, 좁은 격자 바닥 패턴의 맥락에서 하나의 객체를 새로운 것으로만들었다(도 1B). 개방형 필드 박스는 충전 결합 장치 카메라 바로 아래...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 작품은 만성 간질을 가진 마우스에 있는 인식 기능을 평가하기 위한 실험적인 절차를 기술합니다. 많은 다른 행동 시험 패러다임은 마우스18에있는 학습 그리고 기억 기능을 평가하기 위하여 이용됩니다. 모리스 물 미로, 방사형 팔 미로, Y-미로, 상황 공포 컨디셔닝 및 개체 기반 테스트는 가장 자주 사용되는 행동 테스트이며 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다. 그 중에서도 NL, NO 및 PS 시험은 간질 마우스8,,10에서학습 및 기억을 평가하기 위한 효율적이고 간단한 방법이다. 간질 마우스는 행동 세션 도중 예기치 않은 자발적인 포착이 있을 수 있기 때문에, 공포 컨디셔닝, 온화한 기아, 또는 재발하는 발작을 유발할 수 있는,10의해상에 머무르기 위하여 강제적인 동기 부여된 업무에 이용된1...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

기술지원에 감사드린다. 이 작품은 한국 정부의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원(NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167)에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1ml 주사기성심26 또는 30 게이지 바늘과 함께 사용
70% 에탄올덕산UN1170스프레이와 함께 사용하여 상자와 물체를 청소하십시오
검은 커튼불필요한 시각적 단서를 피하기 위해
크레실 바이올렛시그마C5042크레실 바이올렛 염색
극저온 체라이카E21040041티슈용 단면
양면 접착 테이프물체의 견고한 배치를 위해
DPX 마운팅 매체시그마06522
에탄올 시리즈덕산UN1170100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올 용액
좁은 그리드 패턴의 바닥판이효바이오행동실험장비, 판재 크기: 42.5 x 42.5 x 0.5cm, 그리드 크기: 2.75 x 2.75cm
와이드 그리드 패턴의 바닥판이효바이오행동실험장비, 판사이즈: 42.5 x 42.5 x 0.5cm, 그리드 크기: 5.5 x 5.5cm
조도계TES전기전자공사1334A실내 조명 측정용(60Lux)
중환자실Thermocare#W-1
케타민 염산염Yuhan7003경심 관류용 마우스 마취에 사용
LED 램프LungoP13A-0422-WW-04행동 검사실
개체용 조명고무 인형, 50ml 플라스틱 튜브, 유리 코플린 항아리, 플라스틱 T-플라스크, 유리병
오픈 필드 박스Leehyo-bio행동 실험 장비, 크기: 44 x 44 x 31cm
종이 타월Yuhan-Kimberly47201오픈 필드 상자 및 물체를 건조하는 데 사용
파라포름알데히드Merck Millipore1040054% 용액
필로카르핀 염산염만들기 SigmaP6503
눈금자열린 필드 상자에서 물체를 찾는 데 사용
스코폴라민 메틸 질산염시그마S225010X 재고
만들기 스마트 시스템 3.0Panlab비디오 추적 시스템
스톱워치JunsoJS-307마우스의 탐사 활동 측정용
당시그마S9378조직 단면의 cryoprotection를 위해
terbutaline hemisulfate 소금시그마T252810X 재고
비디오 카메라 (CCD 카메라)를 만드십시오 VisionVCE56HQ-12머리 위에 카메라를 직접 놓습니다
엘 한국KR10381
DuksanUN1307 크레실 바이올렛 염색
합 자 열린 필드 상자 xylazine (Rompun)의 바이 경 관류 크실렌 에 대한 마우스 마취에 사용

참고문헌

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 기능의 평가
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.