Method Article

청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑

DOI:

10.3791/60760

⸱

February 7th, 2020

 , 
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 회로를 조사할 때, 시험관 내 패치 클램프 접근법의 표준 제한은 여러 소스의 축슨이 종종 혼합되어 전기 자극을 가진 개별 소스로부터 입력을 분리하는 것을 어렵게 만드는 것입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)을 사용하여, 이러한 한계는 이제 극복 할 수있다. 여기에서, 우리는 낮은 청각 뇌간 핵및 commissural 입력에서 청각 시스템의 중간 뇌 핵인 열등한 콜리큘러스 (IC)에 있는 신경의 확인된 부류에 오름차순 입력을 지도로 하기 위하여 CRACM를 이용하는 방법을 보고합니다. IC에서, 로컬, 커미션, 오름차순 및 내림차순 축색은 무겁게 얽혀 있고 따라서 전기 자극과 구별할 수 없습니다. 시냅스 핵에서 채널로덕신의 발현을 유도하기 위해 바이러스 성 구조를 주입하고, 패치 클램프 기록을 이어서 채널로도셉신 발현 시냅스 입력, 특정 소스로부터의 프로젝션의 존재 및 생리학을 특성화한다. IC 뉴런의 특정 집단에 세포 유형별 정확도로 매핑될 수 있다. 이 접근법은 청색 광 활성화 채널러도셉신인 크로노스와 적색 채널로도이프신인 ChrimsonR과 함께 작동한다는 것을 보여줍니다. 전뇌의 이전 보고서와는 달리, 우리는 ChrimsonR이 등지 달팽이관 핵 주요 뉴런의 축축을 강력하게 인신 매매하고 있음을 발견하며, 이는 ChrimsonR이 뇌간 CRACM 실험에 유용한 도구가 될 수 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 쥐의 등쪽 달팽이관 핵 및 IC에 주사를 표적으로 하는 입체 좌표를 포함하여 두개내 바이러스 주사 수술에 대한 자세한 설명과 전체 세포 패치 클램프 기록을 결합하는 방법 등이 포함되어 있습니다. IC 뉴런에 대한 장거리 프로젝션을 조사하기 위해 채널로도셉신 활성화를 통해 이 프로토콜은 IC에 청각 입력을 특성화하는 데 맞춤화되어 있지만, 청각 뇌간 및 그 너머의 다른 장거리 예측을 조사하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

Introduction

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시냅스 연결은 신경 회로 기능에 매우 중요하지만, 신경 회로 내의 시냅스의 정확한 토폴로지와 생리학은 종종 실험적으로 조사하기가 어렵습니다. 이는 세포 전기 생리학의 전통적인 도구인 전기 자극이 자극 부위 근처의 축사를 무차별적으로 활성화하고 대부분의 뇌 영역에서 다른 소스(로컬, 오름차순 및/또는 내림차순)의 축축을 서로 연결하기 때문입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)1,2를사용하여, 이러한 제한은 이제3을극복 할 수있다 . 채널로도셉신(ChR2)은 원래 녹색 조류 클라미도모나스 린하르트티에서발견되는 광 활성화, 양이온 선택적 이온 채널이다. ChR2는 450-490 nm 의 파장의 청색광에 의해 활성화될 수 있으며, 양이온 유입을 통해 세포를 탈분극화할 수 있다. ChR2는 먼저 나겔과 동료4에의해 제노푸스 oocytes에서 설명하고 표현되었다. 그 직후, Boyden과 동료5 포유류 뉴런에서 ChR2를 표현하고 그들이 안정적으로 밀리 초 타임 스케일에 스파이크를 제어하는 광 펄스를 ....

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Protocol

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현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다. 이 프로토콜의 모든 절차는 미시간 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 승인되었습니다.

1. 수술 준비

  1. 무균 조건에서 수술을 수행합니다. 오토클레이브/수술 전에 모든 수술 도구 및 재료를 소독하십시오. 수술 가운과 마스크를 착용.
  2. 수술 부위를 소독하고(70% 에탄올로 스프레이하고 닦아내고) 멸균 수건 커튼을 놓아 수술 부위를 덮습니다.
  3. 복구 케이지를 준비합니다. 질식의 위험을 제한하기 위해 케이지 침구를 제거하십시오. 가열 패드를 케이지 아래에 놓습니다. 음식과 물 소스를 제공합니다.
  4. 파이펫 풀러에서 나노 인젝터용 유리 모세관을 당깁니다. 당기는 과정 동안 가열 필라멘트의 강렬한 열은 유리 모세관을 살균합니다. 팁을 잘라내거나 끊어 직경 약 5 μm의 개구부를 얻습니다.
  5. 모세관 팁을 약 30° 각도로 경사하여 조직 침투를 개선하고 막힘을 줄입니다. 미네랄 오일로 모세관을 채우고 나노 리터 인젝터에 삽입하십시오.
  6. 원하는 채널로도셉신 인코딩 rAAV의 알리쿼트를....

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Results

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우리는 VIP-IRES-Cre 마우스(VIPtm1 (cre)Zjh/J)와 Ai14 Cre-리포터 마우스 (B6)를 교차했습니다. CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)는VIP 뉴런이 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 F1 자손을 생성한다. 어느 성별의 F1 자손이 사용되었고, 산후일(P) 21 에서 P70으로 사용되었다. 이 연구에서는 총 22마리의 동물이 사용되었습니다.

AAV1의 입체 주입. 표 1에 나타낸 좌표를 사용하여 VIP-IRES-Cre x Ai14 마우스의 오른쪽 IC에 Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH가 오른쪽 IC에서 강한 크로노스-EGFP 발현을 초래하였다(도

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Discussion

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우리는 CRACM이 마우스 IC에 있는 뉴런에 장거리 시냅스 입력을 확인하고 특성화하기 위한 강력한 기술이다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 DCN 및 IC에서 뉴런의 강력한 트랜스펙션뿐만 아니라 IC의 시냅스 터미널에 크로노스와 ChrimsonR의 신뢰할 수있는 축산 인신 매매를 달성했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 PSP 진폭, 하프 폭, 부패 시간 및 수용체 약리학을 포함하여 포스트나피 사건의 측정 그리고 분석을 가능하게 한다는 것을 설명했습니다. 우리의 경험은 이 접근이 청각 뇌간 및 그 너머에 걸쳐 기능적인 회로 매핑 실험을 능력을 발휘하기 위하여 쉽게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.

전반적으로, 광유전학 회로 매핑의 특이성은 축색의 전기 자극에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 바이러스성 형질감염은 시냅스 전 뉴런의 표적 집단에 채널로도인의 발현을 공간적으로 그리고 분자적으로 제한하는 기능을 제공한다. 대조적으로, 전기 자극.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 도이치 Forschungsgemeinschaft 연구 펠로우십 (GO 3060/1-1, 프로젝트 번호 401540516, DG) 및 국립 보건 원부 R56 DC016880 (MTR)에 의해 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AAV1입니다. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH애드진59171-AAV1
AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHAddgene59170-AAV1
Ai14 리포터 마우스(B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J)Jackson Laboratorystock # 007914
호박색 (590nm) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDSP-01-A8
블루 (470nm) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDSP-01-B4
Carproject (carprofen)Henry Schein Animal Health59149
Drummond glas 모세관Drummond Scientific Company3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3Drummond Scientific Company3-300-207
전극 베벨러셔터 기기FG-BV10-D
Ethilon 6-0(0.8 미터법) 나일론 봉합사Ethicon지역 약국
고정 무대 현미경모든n/a
가스 마취 헤드 홀더David Kopf 기구933-B
일반 수술 도구정밀 과학 도구N/A
Golden A5 애완 동물 클리퍼Oster078005-010-003
가열 패드사용자 정의 빌드N/A
진공 시스템 포함 후드 유도 챔버Patterson Scientific78917760
핫 비드 살균기 Steri 250InotechIS-250
요오드 용액 10%MedChoice지역 약국
Isoflurane 기화기Patterson Scientific07-8703592
리도카인 국소 젤리 2%Akorn현지 약국
마이크로 모터 드릴 1050Henry Schein 동물 건강7094351
마이크로 모터 드릴 비트 0.5mmFine Science Tools19007-05
전동 MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285/R
안과 연고 인공 눈물Akorn지역 약국
P-1000 전극 풀러셔터 기기P-1000
패치 클램프 증폭기 포함 데이터 수집 소프트웨어anyn/a
휴대용 마취기Patterson Scientific07-8914724
소동물 스테로택시 프레임David Kopf Instruments930-B
표준 화학 물질현지 공급업체N/A
표준 이미징 솔루션
멸균 수건 드레이프Dynarex4410
수술 마커Fine Science Tools18000-30
온도 조절기사용자 정의 빌드N/A
Vibratomeanyn/a
VIP-IRES-Cre 마우스 (Viptm1(cre)Zjh/J)Jackson Laboratorystock #010908
Water bathanyn/a

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M.

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Channelrhodopsin assisted Circuit MappingInferior Colliculus NeuronsStereotaxic CoordinatesWhole Cell Patch ClampChronos ChrimsonRDorsal Cochlear NucleusLong range ProjectionsAuditory BrainstemViral Injection SurgeryOptical Activation

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