Method Article

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

DOI:

10.3791/60766

⸱

February 11th, 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

태아 알콜 스펙트럼 무질서 (FASD)는 안면 이형성증 및 신경 손상을 포함하여 에탄올 유도한 발달 결함의 높게 변명한 연속체를 기술합니다. 복잡한 병리학으로, FASD는 미국에서 태어난 100명의 아이들에 대하여 대략 1에 매년 영향을 미칩니다. FASD의 매우 가변적인 특성으로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 개발 결함에 대한 현재의 기계적 이해에서 중요한 것으로 입증되었습니다. 점점 더 많은 실험실에서 제브라피시를 사용하여 에탄올로 인한 발달 결함을 검사하는 데 주력하고 있습니다. Zebrafish는 외부에서 수정되고 유전적으로 견인할 수 있는 반투명 배아를 다수 생산합니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 타이밍과 복용량을 정확하게 제어하고 라이브 이미징 기술을 통해 배아 에탄올 노출의 영향을 정량화할 수 있습니다. 이것은 유전학과 인간과의 발달의 높은 수준의 보존과 결합되어, 에탄올 기형의 기계적 기초를 연구하는 강력한 모델로 제브라피쉬가 입증되었습니다. 그러나, 에탄올 노출 식이요법은 이 연구 결과에 걸쳐 제브라피시 데이터의 해석을 혼동한 다른 제브라피시 연구 사이에서 변화했습니다. 여기서는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 프로토콜이다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 배아 에탄올 노출과 관련된 광범위한 신경 장애 및 두개안면이상학을1. 에탄올 노출 및 유전적 배경의 타이밍 및 투여량을 포함한 여러 요인이 FASD2,3의변이에 기여한다. 인간에서는, 이 변수의 복잡한 관계는 공부하고 FASD의 병인학을 이해하는 도전을 만듭니다. 동물 모델은 에탄올 기형의 기계적 기초에 대한 우리의 이해를 개발하는 데 중요한 것으로 입증되었습니다. 다양한 동물 모델 시스템이 FASD의 여러 측면을 연구하는 데 사용되었으며 결과는 인간에서 노출에서 발견되는 것과 현저하게 일치했습니다4. 설치류 모델 시스템은 FASD의 많은 측면을 검사하는 데 사용되며 마우스가 가장 일반적인5,6,7입니다. 이 작업의 대부분은 초기 에탄올 노출에 발달 결함에 초점을 맞추고있다8,에탄올에 나중에 노출뿐만 아니라 개발 이상을 일으키는 것으로 나타났다하지만

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 절차에 사용된 모든 제브라피시 배아는 확립된 IACUC 프로토콜27에따라 사육및 사육되었다. 이 프로토콜은 오스틴텍사스 대학과 루이빌 대학에 의해 승인되었습니다.

참고: 제브라피쉬 라인 Tg(fli1:EGFP)y1은 본 연구에서 사용하였다28. 이 절차에 사용되는 모든 물은 멸균 역삼투수입니다. 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 v8.2.1을 사용하여 수행되었다.

1. 배아 미디어 만들기

  1. 배아 매체의 20x 스톡을 만들기 위해, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, CaCl2,K2HPO4의0.41 g, NA2HPO4의0.142 g, MgSO4·7H2O의4.9 g을 물 1L에 용해한다. 형성하는 백색 침전을 무시하십시오. 이는 미디어에 영향을 미치지 않습니다. 필터는 스톡 용액을 살균하고 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 작업 배아 매질 용액을 만들기 위해, 20x 배아 매물 스톡의 1 L에 NaH....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈액 에탄올 수준은 완전히 형성된 순환 계통이 부족하기 때문에 초기 배아 제브라피시에서 결정될 수 없습니다. 제브라피쉬 배아에서 에탄올 농도수준을 결정하기 위해 에탄올 수준은 균질화된 배아 조직에서 직접 측정됩니다. 배아 에탄올 농도를 적절하게 측정하려면 배아 량을 고려해야 합니다. 배아 (노른자 부착)는 초원 내부에 앉아 (달걀 껍질) 엑스트라 배아 유체에 둘러싸여(그림 1). 배아의 모든 부피는 배아의 크기가 증가함에 따라 배아의 양이 발달 시간에 걸쳐 변화하기 때문에 노출 시 배아에서 이루어져야 합니다. 또한, 배아처리 방법은 배아 부피뿐만 아니라 배아 의 양을 고려해야 하는데, 이는 이 두 원소가 배아 에탄올 수준을 계산하는 데 사용되는 희석 인자를 생성하기 때문이다.

배아는 완벽한 구체가 아니기 때문에, 특히 10 hpf 후에, 물 변위는 배아 부피를 평가하기 위하여 이용되었다. 이 연구는 24 hpf에서 배아를 사용.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개발 모델 시스템인 zebrafish는 환경 요인이 개발에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다. 그(것)들은 에탄올 연구 결과에 있는 정확한 타이밍 그리고 복용량 패러다임을 허용하는 외부기름지게 한 태아의 다수를 일으킵니다. 이것은 살아있는 화상 진찰 기능 및 인간을 가진 유전과 발달 보존과 결합하여, zebrafish를 기형학 연구를 위한 강력한 모형 체계를 만듭니다. 기재된 것은 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아를 개발할 때 배아 에탄올 농도를 측정하기 위한 프로토콜이다.

배아 에탄올 농도를 결정하는 것은 에탄올이 발달 하는 배아에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 설치류 모델에서, 혈액 에탄올 농도는 조직 농도와 상관 관계26. 그러나, 제브라피시의 초기 배아 발달에서 혈액 에탄올 수준을 평가하는 것은 불가능합니다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 제브라피시25.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에 제시된 연구는 J.K.E에 국립 보건원/국립 치과 및 두개안면 연구 (NIH/NIDCR) R01DE020884에서 이전 교부금에 의해 지원되었습니다. 그리고 알코올 남용 및 알코올 중독에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 (NIH / NIAAA) F32AA021320 C.B.L.에 알코올 남용에 대한 국립 보건 원 / 국립 연구소의 현재 보조금에 의해 (NIH / NIAAA) R00AA023560 에 C.B.L. 우리는 가스 크로마토그래프 분석을 제공하고 지원해 준 Rueben Gonzales에게 감사드립니다. 티아나 온티베로스와 지나 노블스 박사의 글쓰기 지원에 감사드립니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
대학에 계약에 의해 제공되는공기
분석 저울VWR10204-962
자동 샘플러, CP-8400바리안가스 크로마토 그래프 자동 샘플러
염화칼슘VWR97062-590
에탄올Decon Labs2701
폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡 2 mLAgilent8010-0198세척 후 바이알을 재사용할 수 있지만 캡/셉타는 재사용할 수 없습니다
가스 크로마토그래프, CP-3800Varian
헬륨대학에 계약에 의해 제공
HP Innowax 모세관 컬럼Agilent19095N-123I30 m x 0.53 mm x 1.0 μ m 필름 두꺼운
Hyrdogen대학에 계약에 의해 제공
황산 마그네슘 (Heptahydrate)Fisher ScientificM63-500
마이크로 원심 분리기 튜브 1.5 mLFisher Scientific2682002
마이크로 피펫 팁 10 μ LFisher Scientific13611106
마이크로 피펫 팁 1000 μ LFisher Scientific13611127
마이크로 피펫 팁 200 μ LFisher Scientific13611112
페트리 접시 100mmFisher ScientificFB012924
Pipetman L p1000L 마이크로 피펫GilsonFA10006M
Pipetman L p200L 마이크로 피펫GilsonFA10005M
Pipetman L p2L 마이크로 피펫GilsonFA10001M
폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡Agilent5190-7021가스 크로마토그래프 바이알용 교체 캡/격막
염화칼Fisher ScientificP217-500
인산칼륨(이염성)VWRBDH9266-500G
PronaseVWR97062-916
실리카 비드 .5mmBiospec Products11079105z
실리카 비드 1.0mmBiospec Products11079110z
중탄산나트륨VWRBDH9280-500G
염화나트륨Fisher ScientificS271-500
인산나트륨(이염기성)Fisher ScientificS374-500
고체상 미세추출, 섬유 어셈블리 Carboxen/PolydimethylsiloxaneMillipore Sigma57343-U교체용 섬유
스타 크로마토그래피 워크스테이션Varian크로마토그래피 소프트웨어
Thermogreen Low Bleed (LB-2) SeptaMillipore Sigma23154Replacement inlet septa
이 있는 가스 크로마토그래프 바이알 륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ethanol QuantificationHead Space Gas ChromatographyZebrafish EmbryosFetal Alcohol Spectrum DisordersProtease Cocktail TreatmentEmbryo Volume MeasurementGas Chromatography AnalysisEthanol Concentration CalculationMedia Reference SamplesEmbryonic Water Content

Related Articles