방법 논문

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

DOI:

10.3791/60769

⸱

2020년 2월 8일

 , 
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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모발 세포 메카노트랜스덕션(MET) 채널은 청력에 중요한 역할을 합니다. 그러나, MET의 분자 정체성 및 구조 정보는 알려지지 않은 남아 있습니다. 모발 세포의 전기 생리학적 연구는 MET 채널이 큰 전도도를 가지며 일부 스타일 염료 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 항생제를 포함하여 상대적으로 큰 형광 양이온 분자에 투과성임을 밝혔다. 이 프로토콜에서, 우리는 기능적 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 이용될 수 있는 Corti 이식의 기관의 머리 세포에 있는 형광 덱스트랜스의 픽업을 구상하고 평가하는 방법을 기술합니다. 우리는 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱스른이 1-2 시간 배양 후 기능성 청각 모발 세포를 구체적으로 라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. 특히, 3 kDa dextran은 기능성 MET 채널이 존재할 때 두 개의 짧은 스테레오실리아 행을 라벨하고 확산 패턴으로 세포체에 축적한다. 라벨링의 추가 소포 같은 패턴은 모발 세포와 주변 지지 세포의 세포체에서 관찰되었다. 우리의 데이터는 3 kDa 텍사스-레드 dextran가 세포 염료 관전자를 위한 2개의 통로를 구상하고 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다; 기능성 MET 채널 및 내분비증을 통한 모발 세포 특이적 진입 경로, 더 큰 덱스렌에 사용할 수 있는 패턴.

서론

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내이의 모발 세포는 소리를 감지하고 궁극적으로 우리의 뇌에 의해 해석되는 전기 신호의 기계적 자극을 은폐하는 감각 세포입니다. 이 세포는 그들의 정점 지역1,2에서돌출하는 스테레오실리아로 알려져 있는 actin 기지를 둔 필라멘트의 3개의 행의 계단 모양 의 묶음을 가지고 있습니다. 기계적 자극은 스테레오실리아 필라멘트를 가장 긴 행쪽으로 편향시키고 메카노트랜스덕션(MET) 채널3의개구부를 트리거합니다. MET 채널의 개통은 세포를 탈분극화하고 결과적으로 모발 세포의 기저 부위에 시냅스 소포의 방출을 신호하는 양이온의 유입으로 이어집니다.

청력에 필수적인 MET 채널의 생물물리학적 특성은 광범위하게 특징지어졌습니다. 다른 특성 들 중, 이들 채널은 양이온 선택적이며 상대적으로 큰 전도도 (낮은Ca2 +에서 150-300 pS)4,5,6,7,8,9,10을갖는다. 놀랍게도, FM1-43 및 텍사스 적색 표지된 아미노글리코시드와 같은 큰 형광 분자는 MET 채널의 퍼시블 차단제이며, 형광 현미경 검사법을 사용하여 가시화될 수 있는 모발 세포체에 축적되는 결과를11,12,13,14. 반대로, 분자 정체성 및 MET 채널및 그 투과 통로의 구조는 애매하게 남아 있습니다. 증가하는 실험적 증거는 막막유사 채널 단백질 1(TMC1)이 성숙한 모발 세포15,16,17,18,19에서MET 채널의 성분임을 나타낸다. 막형 채널 1(TMC1)의 돌연변이는 MET 채널 속성19,20,21,22를 변경하고 청각 장애를 일으킨다. 또한, TMC1은 MET채널(18,23)의 부위에 국소화하고, 기계적 힘을 MET채널(24,25)으로전송하는 것을 담당하는 팁 링크와 상호작용한다. 더욱이, 최근 생물정보학 분석은 TMC 단백질을 메카노민성 채널 TMEM63/OSCA 단백질 및 TMEM16 단백질, 칼슘 활성 염화물 채널 및 지질 스크램블라제 26,27,28와관련된 진화로 확인하였으며,28. 이들 단백질 간의 관계에 기초한 TMC1의 구조적 모델은 단백질-지질계면(27)에서큰 공동의 존재를 밝혀낸다. 이 공동은 상염색체 지배적 난청(DFNA36)을 유발하는 2개의 TMC1 돌연변이(DFNA36)27,29,30,31,32,및 캐비티 내의 잔류물을 위한 시스테인 돌연변이체의 선택적 변형MET 채널특성(28)을수용하며, 이는 MET 채널의 투과 경로로서 기능할 수 있음을 나타낸다. TMC 단백질에 있는 이 예측한 구멍의 큰 규모는 MET 채널을 침투하는 큰 분자의 기능을 설명할 수 있었습니다. MET 채널이 비정상적으로 큰 투과 경로를 포함하고 TMC1에서 관찰된 공동의 크기의 한계를 밀어내기 위해, 우리는 더 큰 분자를 가진 코르티 이식의 기관에서 섭취 실험을 수행하는 프로토콜을 개발, 3 kDa dextran 형광으로 텍사스 레드로 표지.

Dextran은 알파 1,6 글리코시딕 결합에 의해 결합된 많은 D-포도당 분자로 구성된 복잡한 분지 다당류입니다. 물의 높은 용해도, 낮은 세포 독성 및 생체 불활성은 여러 세포 과정을 연구할 수있는 다목적 도구입니다. 또한, 덱스렌은 다양한 크기와 형광으로 여러 가지 색상의 형광로 표지로 제공됩니다. 형광표지덱스트랜스는 세포 및 조직 투과성 연구33,34,다중 세포 시스템35,36,및 신경 추적37,38에서내분비증을 연구하는 데 일반적으로 사용된다. 청각 분야에서, 덱스렌 분자는 또한 코르티39,40의친칠라 기관에서 강렬한 소음에 노출 된 후 세포 세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실을 평가하는 데 사용되었습니다.

이 작품에서, 우리는 뮤린 내이 모발 세포에서 의 한 부분의 관세포 실험을 수행하고 내이 모발 세포 MET 채널의 투과 경로의 크기를 탐구하기 위해 가장 작은 (3 및 10 kDa) 형광 덱스 트랜스의 일부의 특성을 이용했다. 또한, 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM) 880을 사용하여 에어리스캔 검출기가 장착되어 입체 및 청각 모발 세포의 세포체에서 형광 덱젠을 시각화하고 국소화했습니다.

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프로토콜

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동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었다, 이는 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된 (동물 프로토콜 은 KJS에 #1336).

1. 생쥐

  1. C57BL/6J 야생형의 번식 쌍을 세워 동물 시설에서 번식하여 새끼의 생년월일을 제어하고 새끼의 나이를 추적합니다.

2. 달팽이관 해부

  1. 해부를 수행하기 위해 입체 현미경에 가까운 깨끗한 공간을 설정합니다(그림1A). 70% 에탄올을 사용하여 공간과 주변 환경을 청소하고 깨끗한 벤치 패드를 놓습니다. 동물 시체를 폐기하려면 의료 병리학 폐기물(MPW) 비닐 봉지가 필요합니다.
  2. Leibovitz의 L15 미디어로 35mm 요리를 준비합니다.
    참고: Leibovitz의 L-15 세포 매체는 팁 링크의 무결성을 유지하는 데 필요한 1-2 mMCa2+를함유하고 있으며, 세포 건강과 생존을 개선하기 위해 필수 아미노산, 비타민 및 나트륨 피루바테를 함유하고 있습니다. 혈청은 그 잘못 정의된 조성물 및 덱스렌과의 잠재적 간섭으로 인한 실험적 가변성을 피하기 위해 배제되었다.
  3. 산후-6(P6) 마우스를 참수에 의해 안락사시한다.
    참고 : 6 일 된 마우스는 흡입 성 마취제에 다소 내성이 있습니다. 이소플루란 또는 장기간CO2 노출(최대 50분)이 안락사에 사용될 수 있지만, 사망을 보장하기 위해 이차적인 물리적 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
  4. 외과 용 가위를 사용하여 전방에서 후방 끝및 외부 청각 운하를 가로 질러 피상적 인 컷을 만들어 두개골의 피부를 제거하십시오.
  5. 피부를 코쪽으로 접어 두개골을 노출시다(그림2B).
  6. 두개골 의 앞쪽과 눈 선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다(그림 2B-C).
  7. 두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하여 측두골에 노출시(그림 2C-D).
  8. 작은 가위로, 측두골 주위를 자르고 조직을 절제하십시오.
  9. 두 개의 측두뼈를 35mm 접시에 놓고 L15 용지로 덮여 있는지 확인합니다(그림2E).
    참고: 다음 단계는 입체 현미경으로 수행됩니다. 검은 배경은 일반적으로 미세 해부 단계 동안 조직을 시각화하는 데 도움이됩니다.
  10. 와이드필드 접안렌즈(10배 배율(WF10X)와 외부 교류 전류(AC) 할로겐 광원이 장착된 입체 현미경으로 주변 달팽이관 조직, 반원형 운하 및 수술용 집게가 있는 전정 기관을 제거합니다(그림2F).
  11. 덱스렌 및 L15 용지가 달팽이관 덕트에 들어갈 수 있도록 해부된 달팽이관에 두 개의 펑크 경계를 수행합니다.
  12. 9웰 유리 우울증 플레이트에서 각 우물에 Leibovitz의 L15 용지 300mL를 추가합니다.
  13. 각 우물에 적어도 세 개의 해부 된 달팽이를 놓습니다.

3. 덱스렌 라벨링

  1. Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS-CFM)를 10 mg/mL의 최종 농도로 하지 않고 행크스의 균형 잡힌 소금 용액에 덱스렌을 재구성합니다. 이 스톡 용액은 불투명한 검정 튜브(빛으로부터 보호됨)로 aliquoted되고 사용 될 때까지 -30 °C에서 보관되어야합니다.
    참고: 이 프로토콜의 성공적인 결과에는 lysine-fixable dextran의 사용이 중요합니다.
  2. Leibovitz의 L15 용지 500 mL에서 2 mg/mL의 최종 농도로 각 덱젠을 준비합니다.
  3. 달팽이관에서 미디어를 제거하고 2 mg/mL의 최종 농도에서 관심 있는 덱스트란을 포함하는 Leibovitz의 L15 용지를 추가합니다.
    참고: MET 채널의 비율이 나머지41,42에서열려 있지만, 덱스트렌 배양은 MET 채널의 개방 확률을 높이기 위해 이식의 완만한 흔들림으로 수행되었다.
  4. 25°의 기울어진 각도로 3차원 셰이커를 사용하여 부드러운 흔들림(25rpm)으로 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: 형광으로 라벨이 부착된 덱스트렌은 가능하면 빛으로부터 보호되어야 합니다. 2시간 배양 동안 덱스트렌을 보호하기 위해, 알루미늄 호일에 싸인 세포 배양 P150 접시 안에 9웰 유리 판을 놓는다.

4. 화상 진찰을 위한 견본 준비

  1. 덱스렌으로 배양한 후, 2분 동안 미디어를 두 번, HBSS로 한 번 씻는다.
  2. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분 동안 조직을 배양하십시오.
    주의: 포름알데히드에 노출되면 눈, 코 및 상부 호흡기에 자극적일 수 있습니다. 특정 개별에서는, 포름알데히드에 반복된 피부 노출은 알레르기성 피부염 귀착될 수 있는 과민반응을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 포름알데히드는 알려진 인간 발암 물질이며 생식 위험이 의심됩니다.
  3. HBSS로 고정 된 조직을 두 번 신속하고 부드럽게 세척하여 파라 포름 알데히드를 제거하십시오.
    참고 : 달팽이관의 이 발달 단계에서는 측두골의 데칼화가 필요하지 않습니다.
  4. 코르티의 기관을 해부하는 미세 팁 집게로 나선형 인대와 지각 막을 제거하십시오(그림 2G).
  5. 조직의 모든 작은 조각을 제거하고 HBSS로 조직을 씻어.
  6. 형광표지된 파할로이드를 함유한 PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 조직을 투과하여(TR-또는 FITC 라벨이 부착된 덱스트란의 흡수를 각각 테스트할 때 녹색 또는 적색으로 공액화) 1:200 희석하여 F-액틴라벨을 30분 동안 액틴 기반 의 스테레오실리아.
  7. HBSS 완충액으로 매번 2-3회 조직을 세척하여 트리톤과 파할로이드의 과잉을 제거하고, 한 번 PBS로 소금을 제거한다.
  8. 현미경 슬라이드에 코르티 조직의 기관을 장착하고 장착 매체로 덮습니다.
    참고: 티슈를 장착할 때, 모발 세포 스테레오실리아를 포함하는 조직의 측면이 커버슬립을 향하고 있는지 확인하십시오.
  9. 마운팅 미디어를 추가하는 동안 발생하는 잠재적인 기포를 제거하고 커버슬립을 배치하는 동안 새로운 기포가 생성되는 것을 방지합니다.
    참고: 마운팅 매체를 추가하는 동안 생성된 모든 기포를 파이펫으로 흡인합니다. 기포가 커버슬립 아래에 갇히지 않도록 하기 위해 커버슬립 가장자리를 시료 가까이에 놓고 집게 나 파이펫 팁을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 천천히 하강합니다.
  10. 유리 커버 슬립으로 마운팅 매체에 티슈를 덮습니다(그림2H).
    참고: 수치 조리개가 0.4이상인 대점은 #1.5개의 커버슬립(두께 0.17mm)을 사용하도록 설계되었습니다. 잘못된 커버슬립을 사용하면 이미지의 강도와 품질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다.
  11. 장착 된 조직을 실온에서 하룻밤 동안 배양하여 마운팅 매체가 건조하게하고 이미징이 될 때까지 슬라이드를 4 °C에서 저장합니다.

5. 이미지 수집 및 이미지 처리

참고: 공초점 이미지는 초고해상도(SR) 모드43및 63x 대물렌즈에서 32채널 Airyscan 검출기가 장착된 LSM 880 공초점 현미경으로 촬영되었습니다.

  1. 목표에 약간의 침지 오일을 추가합니다.
  2. 침지 오일을 향한 유리 커버슬립을 사용하여 장착된 조직 샘플을 포함하는 현미경 슬라이드를 현미경 단계에 놓습니다.
  3. 샘플에 초점을 맞추고 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 매개 변수를 설정합니다.
  4. 각 독립적인 실험에 대해 동일한 이미지 수집 설정과 x, y 및 z 해상도에 대해 최적의 매개변수를 사용합니다. 이미지의 z 스택을 획득할 때 목표를 빠르고 정확하게 이동하려면 압전 기반 포커스 시스템이 필요합니다.
    참고: 모발 세포의 전체 정점 영역을 이미지화하려면 최적의 설정을 사용하여 스테레오실리아에서 모발 세포 체의 정점 절반까지 이미지의 z 스택을 수집합니다. 소포 와 같은 입자의 이미징을 보장하기 위해 모발 세포를 따라 큰 z 스택을 수집하는 것이 중요합니다.
  5. 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 Airyscan 3D 재구성 알고리즘을 사용하여 자동 기본 데콘볼루션 필터 설정을 사용하여 원시 공초점 이미지를 처리합니다.
  6. 이미지 처리 소프트웨어에서 공초점 이미지를 열어 밝기와 대비를 조정하고 배율 막대를 추가하고 최종 그림에 대한 이미지를 내보냅니다.

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결과

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우리는 텍사스 레드 (dextran-TR)로 표지 된 3 kDa dextran 형광으로 야생 형 산후 - 6 (P6) 마우스에서 코르티 방종의 장기를 2 시간 배양 한 후 모발 세포의 강력하고 구체적인 라벨링을 관찰했습니다(그림 2A-B). Dextran 라벨링은 코르티 의 기관의 기저, 중간 및 정점 영역에서 내부 및 외부 모발 세포(IHC 및 OHC)에서 관찰되었다(도2B).

형광 표지된 파할로이드는 필라멘트 액틴(F-actin)을 역염색하고 액틴 계 모발 세포 스테레오실리아를 시각화하는 데 사용되었다. 우리는 또한 짧은 배양 시간에 유사한 실험을 수행하고, 우리는 모발 세포 체체에 dextran-TR 축적을 관찰했지만, 신호는 2 시간 배양에서보다 약하고 더 많은 변수였다...

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토론

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이 프로토콜은 3 kDa dextran 텍사스 레드와 코르티 이식의 뮤린 기관에서 섭취 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 목표는 이전에 시험된 그 외 보다는 더 큰 분자가 또한 특히 청각 머리 세포를 표지하고 MET 채널을 통해 침투할 수 있었다는 것을 시험하는 것입니다. 유사한 실험 프로토콜은 이전에 FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 (1.29-1.43 kDa)와 같은 다른 형광 염료에 대한 모발 세포의 투과성을 평가하기 위해 이전에 사용되었습니다13,52. 이 형광 분자를 사용하여 모발 세포에 라벨을 붙이는 데 필요한 시간은 크기에 따라 다릅니다. 최대 라벨링은 FM1-43

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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우리는 공초점 이미지 수집을 지원하기 위한 NICHD 현미경 검사법 및 이미징 코어의 빈센트 슈람과 식민지 관리 및 마우스 관리에 귀중한 도움을 준 Tsg-Hui Chang에게 감사드립니다. 이 연구는 NINDS, NIH, 베데스다, MD의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었으며, K.J.S. A.B.는 NINDS, NIH의 교내 연구 프로그램과 교내 연구 프로그램에서 로버트 웬홀드 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. NIDCD의

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#1.5 유리 커버 슬립 18mm워너 인스트루먼트64-0714
알렉사 플루어 488 팔로이딘ThermoFisherA12379
알렉사 플루어 594 팔로이딘ThermoFisherA12381
알파 Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objectiveCarl Zeiss420780-9970-000
아밀로라이드 염산염EMD 밀리포어
Benchwaver 3-dimensional Rocker벤치마킹 과학적B3D5000
C57BL/6J 야생형 마우스균주 000664Jackson Laboratory
Cell impermean BAPTA 테트라칼륨ThermoFisherB1204
Dextran, Fluorescein, 10,000MW, 음이온성, 라이신 고정성ThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10,000MW, 라이신 고정성ThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000MW, 라이신 고정성ThermoFisherD3328
포름알데히드 수용액 EM 등급전자 현미경 과학15710
HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음ThermoFisher14025
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음ThermoFisher14170
Image J 또는 FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F 오일 이멀젼 미디어Carl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz의 L-15 매체, GlutaMAX 보충제ThermoFisher31415029
네오마이신 트리설페이트 염 수화물SigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong 다이아몬드 퇴색 방지 마운팅 미디어ThermoFisherP36970
superfrost plus 현미경 슬라이드Fisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 소프트웨어Carl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
129876염

참고문헌

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