여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
화학 및 바이오 컨쥬게이션 기술은 최근 몇 년 동안 급속히 개발되어 단백질 폴리머의 구축을 허용하고 있습니다. 그러나, 제어 된 단백질 중합 과정은 항상 도전이다. 여기에서, 우리는 합리적으로 통제된 순서에 있는 단계별로 중합된 단백질을 건설하기 위한 효소 방법론을 개발했습니다. 이 방법에서, 단백질 단면제의 C-말단은 OaAEP1(Oldenlandiaaffinis asparaginis asparaginyl endopeptidases)을사용하여 단백질 컨쥬게이션을 위한 NGL인 반면, N-말단은 클레이브 가능한 TEV(담배 에칭 바이러스) 분열 부위와 L(ENLYFQ/GL)을 임시 N-단말 보호를 위한 것이다. 결과적으로, OaAEP1은 한 번에 하나의 단백질 단량체만 을 첨가할 수 있었고, 그 후 TEV 프로테아제는Nh 2-Gly-Leu를 노출시키기 위해 Q와 G 사이의 N-종단을 갈라졌다. 그런 다음 장치는 다음 OaAEP1 결찰에 대한 준비가 됩니다. 엔지니어링 된 다단백질은 원자력 현미경 검사법 기반 단일 분자 힘 분광학 (AFM-SMFS)을 사용하여 개별 단백질 도메인을 전개하여 검사됩니다. 따라서, 이 연구는 다단백질 공학 및 고정화를 위한 유용한 전략을 제공한다.
서론
합성 중합체에 비해, 천연 다중 도메인 단백질은 잘 제어 된 수와 하위 도메인1의유형과 균일 한 구조를 갖는다. 이 기능은 일반적으로 향상된 생물학적 기능 및 안정성2,3을이끈다. 시스테인 계이황화 결합 결합 및 재조합 DNA 기술과 같은 많은 접근법은, 다중 도메인4,5,6,7과같은 중합 단백질을 구축하기 위해 개발되었다. 그러나, 전자 방법은 항상 무작위 및 통제되지 않는 서열을 초래하고, 후자의 방법은 독성 및 대형 단백질의 과발현어려움 및 보조 인자 및 기타 섬세한 효소로 복잡한 단백질의 정제를 포함한 다른 문제를 초래한다.
이러한 과제를 충족시키기 위해, 우리는 프로테아제 TEV8,9와결합된 단백질 리가세 OaAEP1을 사용하여 단계적으로 폴리머/폴리단백질에....
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프로토콜
1. 단백질 생산
-
유전자 클론
- 관심 있는 단백질(POI)을 코딩하는 유전자를 구매하는 유전자: 유비퀴틴, 루브루독신(RD)51,셀룰로오스 결합 모듈(CBM), 도커린-X 도메인(XDoc) 및 루미노크코커스 플라베파시에서응집성,담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELPs).
- 중합효소 연쇄 반응을 수행하고 상이한 단백질 단편으로부터 유전자를 재조합하기 위한 3제한 소화 효소 시스템 BamHI-BglII-KpnI를 사용한다.
- 직접 DNA 시퀀싱으로 모든 유전자를 확인합니다.
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단백질 발현 및 생산
- PQE80L-POI 또는 pET28a-POI 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)을 변환하여 발현합니다.
- 각 항생제 (예를 들어, 100 μg / mL 암피실린 나트륨 소금 또는 50 μg / mL, 카나마이신)와 함께 LB 배지의 15 mL로 하나의 단일 식민지를 선택합니다. 16-20 시간 동안 37 °C에서 200 rpm에서 배양물을 ....
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결과
OaAEP1 결찰에 의해 인접한 단백질 사이에 도입된 NGL 잔기는 전개력(&F u>)및 윤곽 길이 증분(&ΔL c>)으로서 중합체의 단백질 단량체 안정성에 영향을 미치지 않을 것이며(<ΔL c>)는 이전 연구와 비교할 수 있다(그림1). 루브레독신 단백질의 정제 결과는 도 2에나타내고 있다. TEV 절단 후 단백질을 증명하기 위해 제어 서열과 함께 단백질 중합체를 구성하기 위해 다음OaEP1 결찰과 호환되고 시공은 고효율이며, 도 3은 참조로서 SDS-PAGE 이미지를 제공한다. 기능화된 캔틸레버 및 커버슬립 제제의 단계는 도 4에설명되어 있다. 표지 슬립에 대한 효소 생합성 및 폴리단백질의 고정은 도 5.......
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토론
우리는 효소 생합성 및 다단백질의 고정화를 위한 프로토콜을 기술하고 AFM 기지를 둔 SMFS에 의하여 polyprotein 디자인을 확인했습니다. 이 방법론은 폴리 단백질 공학 및 고정4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 21771103, 21977047), 장쑤성 자연 과학 재단 (그랜트 번호) . BK20160639) 및 장쑤성 황추앙 프로그램.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 철 (III) 염화물 육수화물 | 에너지 화학 99 | % | |
| 염화아연 | Alfa Aesar | 100.00 % | |
| 염화칼슘 수화물 | Alfa Aesar | 99.9965 % 결정질 골재 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Life Science | Bio Xtra, ≥ 99.0 %, 결정 ( | |
| 3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 | 시그마 - 알드리치 | ≥ 99% | |
| 설포숙시니미딜 4-(N-말레미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 | Thermo Scientific | 90% | |
| 글리세롤 | 맥클린 | 99% | |
| 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) | 알파 아이사르 | ||
| 유전자 | Genscript | ||
| 장비 | |||
| Nanowizard 4 AFM | JPK 독일 | ||
| MLCT 캔틸레버 | Bruker Corp | ||
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | ||
| AKTA FPLC 시스템 | GE Healthcare | ||
| Glass coverslip | Sail Brand | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Avanti JXN-30 Centrifuge | 벡크만 쿨터 | ||
| 젤 이미지 시스템 | 타논 |
참고문헌
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers.
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재인쇄 및 허가
