인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.
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방법 논문
장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
공초점 화상 진찰을 사용하여 창자의 중요한 현미경 검사는 살아있는 동물에 있는 상피 세포 흘리기 및 장벽 누설의 실시간 관찰을 허용합니다. 따라서 마취된 마우스의 장 점막은 특이하지 않은 스테인링(acriflavine)과 형광 추적자(로다민-B dextran)로 토탈로 염색되어 식염수 용액-헹구는 플레이트에 장착되어 공초점 현미경을 사용하여 직접 이미지화된다. 이 기술은 경구 투여 된 추적자의 경막 통과와 같은 장 투과성의 누설을 식별하기 위해 다른 비 침습적 기술을 보완 할 수 있습니다. 이 외에도 여기에 제시 된 접근 방식은 실시간으로 셀 흘리는 이벤트를 직접 관찰 할 수 있습니다. 적절한 형광 기자 마우스와 함께,이 방법은 장 상피 세포 압출을 제어하는 세포 및 분자 메커니즘뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에 빛을 흘리는 데 적합합니다. 지난 수십 년 동안, 내피성 현미경 검사를 이용한 흥미로운 연구는 내피 투과성, 면역 세포 창자 호밍, 면역 상피 통신 및 발광 성분의 침입에 대한 지식에 기여했습니다. 함께, 여기에 제시 된 프로토콜은 상피 세포 압출을 제어하는 메커니즘의 이해를 증가도움이 될뿐만 아니라, 다른 조직에서도 다른 매우 역동적 인 세포 과정을 시각화하는 도구로 사용되는 다른 접근 법의 발달의 기초가 될 수 있습니다. 기술적 한계 중, 특정 조직의 광학 특성뿐만 아니라 선택된 이미징 기술 및 현미경 구성은 차례로 이미징 작업 거리 및 획득 된 이미지의 해상도를 결정할 것입니다.
서론
장은 유해한 발광 물질에 대한 영양과 보호와 상충하는 프로세스, 즉 영양과 보호를 가능하게 하는 엄격하게 조절된 기능을 가진 고도로 전문화된 기관입니다. 인체와 환경 사이의 안감, 장 상피는 물리적 및 면역 장벽역할을 하며 창자1,,2에서점막 항상성의 유지에 기여한다. 상피 무결성의 상실및 팽팽한 접합 투과성 증가는 염증성 장질환(IBD)3,,4,,5,,6과연관되는 것으로 잘 알려져 있다. 상피 변경은 IBD에 있는 만성 장 염증을 위한 원인 그리고 이차 증폭기로 그 때 고려됩니다. 따라서, IBD 환자의 창자에 있는 초기 상피 변경의 향상한 이해는 IBD 재발의 믿을 수 있는 예측 및 후속 예방을 위한 상피 무결성을 회복하기 위하여 새로운 전략의 발달을 위한 엄청난 가치가 일 것입니다.
장 상피는 복잡하고 엄격하게 규제된 회전율 프로세스를 따릅니다. 토굴 바닥에서, 다능성 줄기 세포에서 유래한 말단 분화장 상피....
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프로토콜
다음 의정서는 에를랑겐(독일 뷔르츠부르크 레게룽 폰 운테르프랑켄)의 관련 지방 당국의 승인을 받았습니다. 마우스는 특정 병원균 없는 조건하에서 보관하였다.
참고: IEC 내GGTase 매개 조형물의 억제는 Pggt1biΔIEC 마우스24에서장 투과성의 심각한 변경을 일으킨다. 따라서, 이 마우스 모델은 프로토콜이 장 장벽 결함을 연구하는 데 어떻게 유용할 수 있는지 를 보여주기 위해 사용되었다. 그러나 이 프로토콜은 다른 마우스 선의 연구에 사용될 수 있습니다.
1. 외과 준비 및 마우스 장 점막 염색
참고: 수술 준비는 이전에 설명된프로토콜(25)을기반으로 합니다. 수술 준비 중에 마취 된 마우스를 빨간 램프 아래에 두어 체온이 떨어지지 않도록하십시오.
- 케타민/자일라진(96 mg/kg 케타민; 12.8 mg/kg 자일라진)의 인트라테오네 주사로 마우스를 마취시킵니다. 눈꺼풀 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다.
- 면 봉오리를 사용하여 아이 보호 크림을 바르습니다.
- 표....
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결과
여기에 제시된 프로토콜은 장 상피 누설을 시각화하고 실시간으로 창자에 있는 세포 흘리기 성능을 관찰하기 위하여 인트라VITAL 현미경 기지를 둔 접근법을 기술합니다. 간단히, 마우스는 소장 점막의 표면을 드러내기 위하여 마취되고 외과 준비에 제출됩니다. 그런 다음 II는 아크리플라빈의 국소 적용을 통해 염색됩니다. 발광 로다민 B-dextran은 루멘에서 하위 상피 공간으로 의 경막 통로를 감지하는 추적자로 사용된다. 따라서, 수술 제제 및 마취 마우스는 페트리 접시에 장착된 슬라이드에 배치되고 CLSM(도1)을사용하여 시간이 지남에 따라 이미지화된다. 취득 후 분석은 결정된 시점에서 전도 누출(파라세포 투과성) 및 "투과성 세포"(세포간 투과성)의 백분율뿐만 아니라 상피 세포 흘리기 속도(세포 흘리기 이벤트/분/기저막의 수)의 계산을 허용합니다.
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토론
기술적으로 도전적이지만, 인트라바이탈 현미경 기반 방법론은 세포 발산 성능과 같은 매우 역동적인 세포 공정을 실시간으로 시각화하는 독특한 실험 적 접근 방식을 나타냅니다. 지금까지 생체 내에서 세포 압출을 시각화하는 대체 실험 적 접근법은 없습니다. 우리는 이 프로토콜이 장 집상성의 유지에 있는 역할을 하는 다양한 세포 프로세스의 설명에 기여할 수 있다고 믿습니다.
인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 로다민 B-dextran)은 공초점 현미경을 사용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다. 표준 추적 실험과 함께 생체 내의 장 투과성 장애의 식별과 파라 세포 및 트랜스 셀룰러 투과성 사이의 구별을 허용합니다. 기자 마우스와 병용하여 상피 세포 흘리기를 모니터링하기 위해 악용된 유사한 프로토콜은 압출 된 세포 (zip-like e.......
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감사의 글
이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합 (FP7/2007-2013)의 REA 보조금 계약 번호 302170에 따라 사람들 프로그램 (마리 퀴리 액션)에서 자금을 받았다; 임상 연구를 위한 학제 간 센터 (IZKF) 대학 에를랑겐 뉘른베르크; 독일 연구위원회(DFG)의 공동 연구 센터 TRR241 및 임상 연구 그룹 KFO257; 그리고 DFG.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아크리플라빈 염산염 | 시그마 알드리치 | A8251 | 의 1mg/mL 용액 |
| BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | ||
| 소작 시스템 | BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | |
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM 현미경 SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL 용액 |
| 표준 펜치 (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23-Straight | |
| fine | scissors Fine Science Tools | 14060-10-Tamoxifen | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in 에탄올 | |
| 자일라진 | 바이엘 | 1320422 |
참고문헌
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
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재인쇄 및 허가
