방법 논문

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

DOI:

10.3791/60806

⸱

2020년 3월 30일

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

이 논문에서

요약

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우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

초록

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포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에 대한 다스펙트럼 형광 이미징을 통해 단일 조직 샘플에서 여러 마커를 검출할 수 있어 마커의 항원 공발 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나, 포르말린 고정 조직에 적합한 항체의 부족은 검출될 수 있는 마커의 성질을 제한할 수 있다. 또한, 염색 방법은 시간이 많이 걸립니다. 여기에서 우리는 동결된 조직에 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰을 능력을 발휘하는 급속한 방법을 기술합니다. 이 방법은 사용되는 형광공 조합, 마우스 및 인간 냉동 조직의 염색을 위한 상세한 단계, 및 스캐닝, 획득 및 분석 절차를 포함한다. 염색 분석을 위해 시판되는 반자동 다스펙트럼 형광 이미징 시스템이 사용됩니다. 이 방법을 통해, 단일 냉동 조직 섹션에서 최대 6개의 상이한 마커를 염색하고 검출하였다. 기계 학습 분석 소프트웨어는 정량 분석에 사용될 수 있는 표현형 세포를 표현할 수 있다. 동결 된 조직에 대해 여기에 설명된 방법은 FFPE 조직에서 검출 할 수 없거나 항체가 FFPE 조직에 사용할 수없는 마커의 검출에 유용합니다.

서론

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현미경 화상 진찰 기술에 있는 최근 어드밴스는 생물학 프로세스 및 질병 상태의 우리의 지식 그리고 이해를 현저하게 향상했습니다. 염색체 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 조직에 있는 단백질의 situ 탐지에서는 병리학에서 일상적으로 수행됩니다. 그러나, 발색성 IHC 염색을 이용한 다중 마커의 검출은 다중 면역형광(mIF) 염색 접근법을 사용하는1가지 및 새로운 방법이며, 여기서 다중 생물학적 마커는 단일 조직 샘플에 표지되고, 개발되고 있다. 다중 생물학적 마커의 검출은 조직 구조, 세포의 공간 분포 및 항원 공생과 관련된 정보가 모두 단일 조직 샘플2에서포착되기 때문에 유용하다. 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰 기술의 사용은 다중 생물학 마커의 검출가능하게 했습니다. 이 기술에서는, 특정 광학을 사용하여 각 개별 형광공의 형광 스펙트럼을 분리하거나 "혼합되지 않은", 어떤 스펙트럼 크로스토크 없이 다중 마커의 검출을 가능하게한다 3. 다스펙트럼 형광 이미징은 세포 생물학, 전임상 약물 개발, 임상 병리학 및 종양 면역 프로파일링4,,5,,<....

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프로토콜

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마우스 비장 및 HLF16 마우스 종양조직(23)은 당사의 실험실로부터 수득되었다. 인간 편도선 조직은 상용 공급 업체로부터 구입되었습니다. 자세한 내용은 재료 표에제공됩니다.

1. 조직 포함

  1. OCT (최적의 절삭 온도) 용액에 신선한 조직을 포함하고 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 동결을 스냅.
  2. 조직을 -80 °C에서 보관하십시오.

2. 냉동 부속

  1. -25 °C로 설정된 온도로 저온 극저온에서 8 μm 섹션을 잘라냅니다.
    참고: 선호하는 단면 두께를 조정하여 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다.
  2. 충전된 유리 슬라이드에 섹션을 놓습니다.
  3. 10 분 동안 반학 등급 얼음 차가운 아세톤에 고정하기 전에 실온 (RT)에서 1 시간 동안 섹션을 공기 건조.
    참고: 아세톤은 수용성 단백질의 응고를 일으키고 지질을 추출하지만 탄수화물 함유 성분에는 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, 포르말린은 대부분의 지질을 보존하고탄수화물....

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결과

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냉동 비장 섹션에서 단일 염색 마커 검출
반자동 이미징 시스템은 더 넓은 범위의 파장검출(25)을가능하게 하는 액정 튜닝 필터(LCTF) 시스템을 사용하며, 여기서 신호 증폭 단계가 수행되지 않기 때문에 현미경의 각 마커에 대한 1차 공액 항체의 검출을 먼저 최적화했습니다. 그림 1에는각 단일 염색 마커가 의사 색상의 빨간색인 예가 나와 있습니다. 여기에서 사용된 알렉사 플루어 공액 항체는 면역형광 및 유세포 측정을 위한 회사에 의해 검증되었습니다. 그러나 Per-CP-Cy5.5 형광단은 유세포 측정에 대해서만 검증됩니다. 우리는 우리의 단 하나 염색한 미끄럼틀에서 이 색깔을 검출할 수 있었습니다, 다중 스펙트럼 화상 진찰에서 사용하기 위하여 유세포 측정 검증 항체의 적합성을 지원하고 2개의 다른 기술 (즉, 유동 세포분석 및 다중 스펙트럼 화상 진찰)를 사용하여 관측을 검증하기 위하여 그 같은 항.......

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토론

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냉동 조직은 MIF 이미징을 위해 광범위하게 사용되어 왔으며 전통적으로 직접 및 간접 방법32를사용하여 조직에 3~4개의마커(31)를 검출하였다. 직접적인 방법에서, 항체는 조직을 표지하기 위하여 형광 염료 또는양자점(33)에 공액되고, 반면 간접적인 방법에서는, 비공액 1차 항체는 1차 항체를 특이적으로 인식하는 형광공 결합이차 항체에 선행하여 조직을 표지하는데 사용된다. 앞서 논의된 최근의 동시 멀티플렉스 염색 접근법 중 일부는 냉동 조직을 염색하고 4개 이상의 마커를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 그러나 시약에 대한 비용과 염색에 소요되는 시간은 검출되는 마커의 수에 따라 집중적이 된다. 동결 된 조직에 대한 또 다른 멀티 플렉스 기술은 다중 에피토프 - 리간드 - 지도 제작 (MELC)34입니다. 기술은 불소 공액 항체, 화상 진찰 및 불소의 광표백.......

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공개 사항

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저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

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화상 진찰 및 분석 지도는 연구 자원 센터에 의해 제공되었습니다 – 연구 조직학 및 시카고에 있는 일리노이 대학에 있는 조직 화상 진찰 코어는 연구를 위한 부총장의 사무실에서 지원으로 설치했습니다. 이 작품은 NIH/NCI RO1CA11317에 의해 CLP에, NIH/NIAMS (SBDRC 교부금 1P30AR075049-01)에 의해 A. Paller 박사에게, 그리고 노스웨스턴 대학의 면역 요법 평가 코어에 로버트 H. 루리 종합 암 센터의 지원에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세톤(조직학적 등급)Fisher ScientificA16F-1GAL고정 조직
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3BioLegend100212Clone - 17A2; 1차 공액 항체
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; 1차 복합 항체
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67BD Biosciences5586171차 접합 항체
Alexa Fluor 594 anti-human CD3BioLegend300446Clone - UCHT1; 1차 복합 항체
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; 1차 복합 항체
Alexa Fluor 647 anti-human CD8aBioLegend372906Clone - C8/144B; 1차 복합 항체
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 AntibodyBioLegend100426Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 MouseCharles River Laboratories27Mouse frozen tties used for multispectral training
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EA슬라이드 수화 및 세척
DAPI 솔루션BD Biosciences564907핵산 염색
다이아몬드 화이트 유리 하전 슬라이드DOT ScientificDW7590W접착 조직 절편
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x (Ca 및 mg 제외)Fisher ScientificMT21031CV세척 및 희석제
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306염색된 조직 보호
인간 정상 편도선 OCT 동결 조직 블록AMSBioAMS6023다중 스펙트럼 염색에 사용되는 인간 냉동 조직
인간 혈청 1xGemini Bio-Products100-512인간 조직 차단 및 희석제
inFormAkoya Biosciences버전 2.4.1기계 학습 소프트웨어
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; primary conjugated antibody
PhenochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965마운팅 매체
연구 : 저온 유지 장치Leica BiosystemsCM3050 S절편 조직
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515블로킹 마우스 조직
Tissue-Tek O.C.T 솔루션Sakura Finetek4583임베딩 티슈
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 SlideAkoya BiosciencesCLS142568반자동 멀티 스펙트럼 이미징 시스템
Vectra 소프트웨어Akoya Biosciences버전 3.0.5현미경 작동 소프트웨어
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

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재인쇄 및 허가

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