우리는 마우스 정자 capacitation 도중 당해 및 산화 인산화에 있는 실시간 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다.
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방법 논문
세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.
이 논문에서
요약
초록
포유류 정자는 capacitation로 알려져 있는 프로세스에 있는 여성 생식 기관에 있는 풍부하게 함 용량을 취득합니다. 정전 관련 공정에는 에너지가 필요합니다. 정자 진보적 인 운동성 연료 ATP를 생성하는 소스에 대한 지속적인 논쟁이 남아있다, 용량, 과소 활성화, 및 곡예 반응. 여기에서, 우리는 마우스 정액 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 분석하는 공구로 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다. H+및O2- 민감한 형광을 사용하여, 이 방법은 비 커패시타이드 대 정전 용량 정자에서 실시간으로 글리코용및 산화 인산화를 모니터링할 수 있게 합니다. 다른 에너지 기판 및 /또는 약리 활성제 및 / 또는 억제제의 존재에서이 분석법을 사용하여 다른 대사 경로의 기여와 정자 capacitation 동안 신호 캐스케이드와 신진 대사 사이의 교차점에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
서론
질량 분석법의 적용은 신진 대사의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 표적 대사 프로파일링 및 대사체 추적을 통해 에너지 대사 의 변화를 정밀하게 모니터링할 수 있습니다. 그러나 대사체학을 성공적으로 수행하려면 광범위한 교육, 숙련된 직원, 고가의 고감도 질량 분석기가 모든 실험실에서 쉽게 구할 수 없습니다. 최근에는 해마 XFe96과 같은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 다양한 세포 유형1,2,3,4,5에서에너지 대사의 변화를 측정하는 대리 방법으로 인기를 끌고 있다.
정자는 고도로 전문화된 운동성 세포입니다; 그의 임무는 난모세포에 친자 게놈을 전달하는 것입니다. 사정 후 남성 생식 기관을 떠나는 정자는 여전히 기능적으로 미숙하며 난모세포의 조끼를 관통할 수 없기 때문에 난모세포를 비옥하게 할 수 없습니다. 정자는충혈6,7로알려진 성숙 과정에서 여성 생식....
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프로토콜
정자는 8-16주령의 CD-1 수컷 마우스로부터 수집된다. 동물 실험은 웨일 코넬 의학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 분석 전날
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센서 카트리지 및 세포외 플럭스 분석기 교정기 준비
- 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 XFe96 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 25 mL의 이중 증류 H2O로 용액 저장소를 채우고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 μL의 H2O를추가하십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 넣고 37°C비CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
참고: 카트리지는 최소 4시간 동안 수분을 공급해야 합니다. - 세포외 플럭스 분석기 교정제의 Aliquot 25 mL을 50 mL 원추형 튜브내로 교정하고 37°C비CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하였다.
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코나 코팅 마이크로플레이트 의 준비
- 2.5 mg의....
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결과
이 방법은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 당해 및 옥스포스 의 비율의 실시간 변화를 모니터링합니다. 도 4는 정자가 유일한 에너지 기판으로서 포도당의 존재에서 정전되었고 2-DG 및 항마이신 및 로테인을 약리학적 변조기로서 가꾸어낸 예시적인 실험을 나타낸다. 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 및 약리학적 변조기 내의 에너지 기질은 실험의 목표에 따라 자유롭게 선택될 수 있다. BSA/TYH에 있는 비 정전 용량 마우스 정액은 그들의 머리를 통해 ConA 코팅된 과도 마이크로 챔버의 바닥에 부착되었습니다. 이 예에서, 검출된 모든 웰 들 사이의 평균 기저 ECAR 및 OCR 값은 각각 12.76±2.75 mpH/min 및 23.64±2.78 pmol/min이었다.
TYH 완충액을 가진 모의.......
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토론
특정 신진 대사 기질 또는 중요한 신진 대사 효소의 부재에 있는 정액 capacitation의 손실은 성공적인 풍부하게 함을 지원하는 중요한 요인으로 에너지 물질 대사를 밝혔습니다. 세포 활성화 도중 신진 대사 스위치는 그밖 세포 모형에 있는 잘 확립된 개념입니다, 그러나, 우리는 정액이 capacitation 도중 증가하는 에너지 수요에 그들의 물질 대사를 적응하는 방법을 이해하기 시작했습니다. 세포외 플럭스 분석기를 사용하여, 우리는 정자 capacitation 도중 실시간으로 글리코용해 및 산화 인산화에 있는 변경을 감시하기 위하여 쉽게 적용 가능한 공구를 개발했습니다. 센서 프로브에 고정된 형광단을 사용하여 세포외H+와 O2의 변화를 감지하는 것은 최소 침습적이며, 4개의 개별적으로 작동된 주입 포트는 용량 화 과정 전이나 동안 별개의 시점에서 약리학적 억제제 또는 활성제와 함께 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 정자 용량 실험의 한 가지 예만 제공합니다. 결과의 해석을 단.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 록펠러 높은 처리량 및 분광학 자원 센터에서 박사 라보이시에 라모스 -Espiritu의 지원을 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; DMSO(111.1 mg/ml)에서 500 mM 원액을 준비하고 작은 부분 표본에 보관 |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 안타; DMSO(2.7mg/ml)에서 5mM 원액을 준비하고 |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A1470 | BSA |
| 염화칼슘 | 시그마-알드리치 | C1016 | CaCl2 |
| 콘카나칼린 A, 아라키스 하이포게아 (땅콩)의 렉틴 | 그마-알드리치 | L7381 | ConA |
| 포도당 | 시그마-알드리치 | G7528 | |
| 헤페스 | 시그마 -알드리치 | H0887 | |
| 이소 thesia | 헨리 샤인 동물 건강 | 1169567761 | 이소 플루란 |
| 황산 마그네슘 | 시그마 - 알드리치 | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O- 디 부티 릴라 데노신 3 ', 5'- 고리 형 일 인산 나트륨 염 | 시그마 -알드리치 | D0627 | db-cAMP |
| 염화칼륨 | 시그마 -알드리치 | P9333 | KCl |
| 인산이수소 | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; DMSO (2mg/ml)에 5 mM 원액을 준비하고 작은 부분 표본에 보관 |
| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment 및 재료 < / Strong > | |||
| 12 채널 피펫 10-100 μ L | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12채널 피펫 50-300 μ L | vwr | 613-5257 | |
| 37 ° C, non-CO2 인큐베이터 | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tube | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | vwr | 76211-286 | |
| 플레이트가 있는 원심분리기 | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| 40X 대물 | Nikon | ||
| , 25 ml, 분리형 | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool 솔루션 리저버, 25 mL, | 분할 Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 분석기 | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | XFe96 FluxPak mini(102601-100)로 판매되며 18캐럿 대신 6캐럿이 있습니다. |
참고문헌
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D.
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재인쇄 및 허가
