방법 논문

성인 쥐의 복합 재생 말초 신경 인터페이스 (C-RPNI)의 제조

DOI:

10.3791/60841

⸱

2020년 2월 25일

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

이 논문에서

요약

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다음 원고는 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)라고 불리는 생물학적, 폐쇄 루프 신경 피드백 시스템을 개발하기 위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 구조는 주변 신경과 통합하여 원심성 모터 신호를 증폭하는 동시에 구심성 감각 피드백을 제공하는 기능을 가지고 있습니다.

초록

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신경 보철에 있는 최근 어드밴스는 결석 한 사지에 네이티브 많은 기능을 재현하기 위해 사지 손실을 가진 사람들을 가능하게하고, 이것은 종종 말초 신경계와의 통합을 통해 달성된다. 불행 하 게도, 현재 사용 하는 방법은 종종 장기간된 사용을 방지 하는 중요 한 조직 손상과 관련 된. 또한, 이러한 장치는 복잡한 구조로 인해 사용자가 이전에 더 간단한 보철을 사용할 때 의존했을 수 있는 진동이나 기타 감각을 약화시킬 수 있기 때문에 감각 피드백의 의미 있는 정도가 부족한 경우가 많습니다. 복합 재생 말초 신경 인터페이스 (C-RPNI)는 동시 구심성 감각 피드백을 제공하면서 원심성 모터 신경 신호를 증폭할 수있는 안정적이고 생물학적 구조로 개발되었습니다. C-RPNI는 근육 이식의 우선 모터 신경 재심 및 진피 이식의 감각 신경 재심과 함께 대상 혼합 감각 신경 주위에 고정 된 자유 진피 및 근육 이식의 세그먼트로 구성됩니다. 쥐에서, 이 구조는 화합물 근육 작용 전위 (CMAP)의 생성을 입증했다, 마이크로 - 밀리 볼트 수준에서 대상 신경의 신호를 증폭, 약 30-50 평균 잡음 비에 신호와. 구성물의 진피 성분의 자극은 근위 신경에서 복합 감각 신경 작용 전위(CSNAPs)를 생성한다. 따라서, 이 구조는 이상적이고 직관적인 보철물의 실현을 향한 미래의 유틸리티를 약속합니다.

서론

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사지 절단은 190명의 미국인1에있는 거의 1에 영향을 미치고, 그들의 보급은 2050년2년까지160만에서 360만 이상으로 증가할 것으로 예상됩니다. 천년 이상 에 대한 문서화 된 사용에도 불구하고, 이상적인 보철은 아직 실현되지않았습니다 3. 현재, 네이티브 말단4,5의많은 운동 기능을 재현 할 수있는 잠재력을 가진 여러 관절 조작이 가능한 복잡한 보철이 존재한다. 그러나, 이러한 장치는 원하는 보철 운동이 전형적으로 입력 제어 신호와 기능적으로 분리되기 때문에 직관적인 것으로 간주되지 않는다. 사용자는 일반적으로 이러한 "고급 보철물"을 배우기 어렵고 따라서 일상적인 사용에 적합하지 않다고 간주1,6. 또한 현재 시판중인 복잡한 보철은 적절한 제어를 위해 미묘한 감각 피드백을 제공하지 않습니다. 터치와 프로피오셉션의 감각은 일상적인 작업을 수행하는 데 필수적이며, 이러한 없이는 커피 한 잔을 집어 들고 같은 간단한 행위가 시각적 단서7,8,9에전적으로 의존하기 때문에 부담이됩니다. 이러한 이유로 고급 보철은 상당한 정도의 정신적 피로와 관련이 있으며 종종 부담스리고 만족스럽지 않은5,10,11로설명됩니다. 이를 해결하기 위해 일부 연구실에서는 직접 신경 상호작용12,13,14,15를통해 제한된 수준의 감각 피드백을 제공할 수 있는 보철을 개발하였지만, 피드백은 손과 손가락에 작고 흩어진영역(12,13)및 감각이15시에고통스럽고 부자연스럽다고 지적되었다. 이러한 연구의 대부분은 불행하게도 지방 조직 효과를 묘사하기 위해 어떤 상당한 장기 후속 및 신경 조직학부족, 달에 주 에 의 한계 실패를 지적하면서16.

이 인구를 위해, 이상적인 보철 장치는 그들의 일생 내내 개별의 환경에서 의미 있는 체감각 피드백과 더불어 높은 충실도 모터 통제를 제공할 것입니다. 이러한 이상적인 보철물의 설계에 중요한 것은 원심성 체감각 정보를 원심성 모터 신호와 동시에 전송할 수 있는 안정적이고 신뢰할 수 있는 인터페이스의 개발입니다. 현재 인간-기계 인터페이스의 가장 유망한 것은 말초 신경계와 직접 상호 작용하는 것들이며, 신경 통합 보철 분야의 최근 발전은 생체 전기 및 기계적 신호 사이의 격차를 해소하기 위해 노력해 왔으며17. 활용 전류 인터페이스는 다음과 같습니다 유연한 신경 플레이트14,15,18,초 신경 커프 전극13,19,20,21,22,23,조직 관통 전극24,25,31,32,및 파자내 전극26,27 ,28. 그러나, 이들 각각의 방법은 만성 내적 이물질 반응과 관련된 신경 특이성, 조직 손상, 축색 변성, 미엘린 고갈 및/또는 흉터 조직 형성에 관한 제한을 입증했다16,17,18,19. 최근에는 최종 이식 된 전극 실패 의 뒤에 드라이버가 전자 물질과 네이티브 신경 조직 사이의 영의 계수에 상당한 차이가 있다고 가정하고있다. 뇌조직은 매일 상당한 미세운동을 일으키며, 영의 변둘리의 차이에 의해 유발된 전단 스트레스가 염증을 일으키고 결국 영구적인 흉터를 남기는30,31,32라고이론화되어 왔다. 이 효력은 말초 신경이 생리적인 micromotion 및 의도적인 사지 macromotion 둘 다의 대상이 되는 사지에서 수시로 복합됩니다. 이러한 일정한 움직임으로 인해 완전히 비생물적인 말초 신경 인터페이스의 활용이 이상적이지 않으며 생물학적 구성 요소와의 인터페이스가 더 적합하다고 결론짓는 것이 합리적입니다.

생물학적 구성 요소에 대한 이러한 필요성을 해결하기 위해, 우리의 실험실은 재생 말초 신경 인터페이스라는 생물 신경 인터페이스를 개발 (RPNI) 보철 장치와 잔여 사지에 transected 말초 신경을 통합. RPNI 제조는 외과적으로 말초 신경을 자가 무료 근육 이식편으로 이식하는 것을 포함하며, 이는 이후에 재혈관화및 재심을 불러오게 합니다. 우리의 실험실은 지난 10 년 동안이 생물학적 신경 인터페이스를 개발했으며, 동물 및 인체 실험에서 이식 된 전극과 결합 할 때 모터 신호를 증폭하고 전송하는 데 성공하여 여러자유도의적절한 보철 제어를가능하게했습니다 2,34. 또한, 우리는 별도로 진피 이식편에 내장된 말초 신경의 사용을 통해 감각 피드백을 입증하, 진피 감각 인터페이스 (DSI)3,35라고합니다. 더 말단 절단에서, 이 구조물을 동시에 사용하는 것은 표적 말초 신경 내의 모터 및 감각 근막이 외과적으로 분리될 수 있기 때문에 가능하다. 그러나, 더 근위 수준 절단을 위해, 이것은 모터와 감각 섬유의 혼합 때문에 가능하지 않습니다. 복합 재생 말초 신경 인터페이스 (C-RPNI)는 더 근위 절단을 위해 개발되었으며, 진피 이식편 세그먼트에 고정 된 자유 근육 이식으로 구성된 구조로 혼합 감각 신경을 이식하는 것을 포함합니다(그림 1). 말초 신경은 우선적으로 표적 화된 재원화를 나타내므로 감각 섬유는 진피 이식편과 운동 섬유, 근육 이식편을 다시 내면화합니다. 이 구성은 따라서 동시에 체감각 피드백36 (그림 2)을제공하면서 모터 신호를 증폭할 수있는 능력을 가지며, 이상적이고 직관적이며 복잡한 보철을 실현할 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회의 승인을 받아 수행됩니다.

참고: 기증자 쥐는 피부와 근육 기증 절차 전에 음식과 물에 무료로 접근 할 수 있습니다. 안락사는 심부 마취하에 수행되고 심박내 염화칼륨 주사는 양측 기흉의 보조 방법으로 수행됩니다. 쥐의 어떤 긴장든지 이론적으로 이 실험으로 이용될 수 있습니다; 그러나, 우리의 실험실은 남성과 여성 Fischer F344 쥐모두에서 일관된 결과를 달성했다 (~ 200-250 g) 나이의 2 ~ 4 개월. 공여자 쥐는 실험쥐에 등소성이어야 한다.

1. 진피 이식편 준비

  1. 0.8-1 L/min에서 산소에 있는 5% 이소플루란의 용액을 이용하는 유도 챔버에 있는 기증자 쥐를 마취합니다. 일단 쥐가 마취되면, 유도 챔버에서 제거하고 호흡 코 콘에 배치, 마취의 유지 보수를 위해 이소플루란을 2-2.5 %로 낮춘다.
  2. 진통을 위한 견갑골 사이 피하 멸균 식염수의 0.2 mL에 0.02-0.03 mL Carprofen (50 mg/mL)의 용액을 관리하십시오.
  3. 각막 궤양을 방지하기 위해 두 눈에 인공 눈물 연고를 적용하십시오.
  4. 클리퍼를 사용하여 전체 하반신, 발목 영역 및 발(들)의 측면을 면도합니다.
  5. 선택한 뒷다리와 발바닥 표면을 알코올로 정화한 다음 iodopovidone 용액을 제거하고 잔류 요오도포비드톤을 제거하기 위해 알코올로 최종 정화합니다.
  6. 탈착식 둥근 미세 모래 연마 돌 (4000 rpm)과 휴대용 마이크로 모터 고속 드릴을 사용하여, 표피를 제거하기 위해 발의 발바닥 표면을 버. 버링하는 동안, 피부를 구울 수 있도록 식염수의 물방울을 적용하십시오. 근본적인 진피는 뾰족한 출혈을 가진 빛나는 외관을 가질 것입니다.
  7. 혈류를 늦추기 위해 하반신에 지혈대를 바르세요.
  8. #15 메스로 발바닥 피부를 날카롭게 제거하고 탈수 방지를 위해 식염수 축축한 거즈에 놓습니다. 일부 건성 및 결합 조직은 본질적으로이 단계에서 피부와 함께 제거되고 나중에 제거됩니다.
  9. 출혈을 늦추기 위해 출혈 발에 거즈 랩을 적용하십시오. 두 구문 작업을 수행하는 경우 1.5-1.9 단계를 반복합니다.
  10. 현미경 (20 배율)에서 미세 가위를 사용하여 피부 이식의 깊은 층에서 힘및 결합 조직을 제거하십시오. 접목에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 얇아진 진피 이식편은 진피만을 함유하여 약간 불투명해야 하며, 크기는 약 0.5 cm x 1.0cm입니다.
  11. C-RPNI 구성 제작을 위해 준비될 때까지 식염수로 적신 거즈에 놓습니다. 이식은 수확 후 2시간 이내에 활용되어야 합니다.

2. 근육 이식의 준비

  1. #15 메스로 발목 바로 아래에서 무릎 바로 아래까지 하반신의 앞쪽 측면을 따라 세로 절개를하십시오. 피하 조직을 통해 해부하여 근본적인 근육을 노출시하십시오.
  2. 절개의 말단 양상에서, 하반신 근육의 건성 삽입을 노출. Tibialis 전방 (TA) 일반적으로 가장 크고 가장 앞쪽 근육, 그리고 바로 아래이 근육에 후방 거짓말 이근외 디지튜룸 longus (EDL). 이 시점에서 삽입을 절개하지 않도록주의하면서 지역의 다른 힘줄에서 원위 EDL 힘줄을 분리하십시오.
  3. 힘줄 아래에 집게의 두 tines를 삽입하고 힘줄 소풍을 일으키는 원인이 되는 집게를 열어 상향 압력을 가하여 정확한 힘줄의 격리를 확인합니다. 이 힘줄을 조작하면 모든 발가락이 동시에 확장됩니다.
  4. 날카로운 홍채 가위로 원위 절제술을 수행하고 근위축 (또는 다른 무딘 기울어진 가위)으로 주변 조직에서 근육을 둔하게 분리하여 힘기원을 찾기 위해 근면하게 작동합니다.
  5. 근위 힘줄이 시각화되면, 다시 날카로운 홍채 가위를 사용하여 tenotomy을 수행합니다. 탈수 방지를 위해 근육 이식편을 식염수축 거즈에 놓습니다.
  6. 모든 원하는 접목이 기증자 쥐에서 제거되면, 주로 심장 내 KCl 주입 (1-2 mEq K +/kg)에 의해 안락사하고 #15 블레이드가있는 양측 천공 기흉이있는 이차 안락사로 안락사를 합니다.

3. 일반적인 peroneal 신경 격리 및 준비

  1. 1.1-1.3 단계에 설명된 프로토콜에 따라 실험 쥐에 진통을 마취시키고 제공합니다.
  2. 원하는 허벅지를 면도하고 알코올, 베타딘으로 정화하고 알코올로 마무리하여 베타딘의 흔적을 제거하십시오.
  3. 수술 준비 테이블에서 수술 용 현미경 테이블로 동물을 옮기고 체온 유지를위한 온도 프로브가있는 가열 패드에 놓습니다. 이소플루란을 2-2.5%로 유지하고 산소를 0.8-1 L/min로 유지하십시오.
  4. 절개를 표시, 무릎의 열등한 부분에 단지 말단에서 sciatic 노치로 확장. 이 표시는 대퇴골보다 열등하고 멀리 기울어져야합니다. 기본 이두근 femoris 근막을 통해 절개 #15 블레이드로 절개를합니다.
  5. 조심스럽게 이두근 femoris 근육을 통해 해부 중 지저분하거나 무딘 팁 마이크로 가위 가위 기본 이두근 femoris공간에.
    참고: 자골신경은 처음 절개된 것과 거의 같은 방향으로 이동합니다. 세 가지가 있다, 일반적으로 sural 신경 후방 및 일반적인 peroneal 및 경골 신경 여행 피상적 및 무릎에 깊은, 각각.
  6. 일반적인 peroneal (CP) 신경의 확인에 따라, 마이크로, 미세 팁 집게 및 마이크로 가위 한 쌍을 사용하여, 주의 깊게 다른 좌골 가지에서 CP 신경을 분리하고 모든 느린 결합 조직을 제거.
  7. 신경이 무릎 의 표면을 교차하는 지점에서 마이크로 가위로 신경을 급격히 전환합니다.
    참고 : 날카로운 가위를 사용하는 것은 신경에 중요한 외상을 일으키는 신경 종 형성의 위험을 증가시킬 수 있기 때문에이 단계에서 매우 중요합니다.
  8. CP 신경에서 남아 있는 결합 조직을 조심스럽게 풀어내고 약 2 cm의 길이로 신경을 풀어 주려고 근면하게 일합니다.

4. C-RPNI 구조 제작

  1. 식염수 축축한 거즈에서 근육 이식편을 제거하고 모든 중앙 건성 조직과 작은 중앙 부분의 에미슘을 제거합니다. 건반 끝을 그대로 둡니다.
  2. 8-0 사용 나일론 봉합사, 신경의 양쪽에 두 개의 중단 된 바늘과 상피의 결여 근육 이식의 영역에 CP 신경의 transected 끝의 상피를 확보.
  3. 단일 6-0 나일론으로 대퇴골 골막에 근육 이식편을 고정하여 대퇴골에서 멀리 향하는 신경 근육 접합부로 근위축을 모두 근위축성 및 경도적으로 중단시켰습니다.
    참고: 근육을 고정하여 정상적인 이완 길이로 유지합니다. 근육을 크게 스트레칭하거나 고정 할 때 너무 많은 느슨함을 남기지 않도록하십시오.
  4. 8-0 배치 나일론 스티치 근육 이식에 열등한, 근육 이식 에피미슘의 중앙 마진, 근육 이식 내의 신경에 느슨함을 생성하고 나중에 앰블리션으로 노출될 수 있는 미래의 긴장을 완화하는 데 도움이 되는 방식으로 CP 신경 상피에 고정한다.
  5. 식염수 축축한 거즈에서 피부 이식편을 제거하고 신경과 근육의 대부분을 완전히 덮는 방식으로 근육 이식편에 배열하십시오. 진피의 깊은 여백이 근육에 놓여 있는지 확인하십시오. 근육의 테두리를 넘어 확장되는 진피를 다듬습니다.
  6. 8-0을 사용하여 근육 이식편을 둘레에 고정 나일론은 봉합사를 중단. 일반적으로 구술의 크기에 따라 총 봉합사가 4-8개가 사용됩니다.
  7. 5-0 크로믹 봉합사로 실행 중인 방식으로 구조물 위에 이두근 페모리스 근막을 닫습니다.
  8. 러닝 패션에서 4-0 크로믹 봉합사로 오버리 스킨을 닫습니다.
  9. 알코올 패드로 수술 부위를 면봉하고 항생제 연고를 적용하십시오.
  10. 흡입 마취를 중단하고 쥐가 케이지 메이트와 분리된 음식과 수원으로 회복할 수 있도록 하십시오.

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결과

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쥐가 감염을 개발하거나 외과 마취를 생존하지 않는 경우 건설 제작은 실패한 것으로 간주됩니다. 이전 연구는 이러한 구조가2,3,17,36을재설계하고 재심하는 데 약 3 개월이 필요하다고 밝혔습니다. 3개월의 복구 기간에 따라 구사 테스트를 통해 실행 가능성을 검사할 수 있습니다. 3개월 후 구조물의 외과적 노출이 성공하면 근육과 피부가 회복될 수있습니다(도 3). 때때로, 자유 근육과 진피 이식편은 흉터 조직으로만 구성될 수 있으며/ 또는 신경은 구성에 부착되지 않을 것입니다. 이러한 결과는 실패한 시도를 나타냅니다. 그러나, 성공하는 경우, 구조에 근접 집게와 일반적인 peroneal 신경...

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토론

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C-RPNI는 구심성 감각 피드백의 제공과 대상 신경의 모터 원심 신호의 동시 증폭을 제공하는 새로운 구조입니다. 특히, C-RPNI는 운동및 감각 근막이 수술 중 기계적으로 쉽게 분리될 수 없기 때문에 근위 절단수술을 받은 사람들에게 독특한 유용성을 가지고 있습니다. 대신, C-RPNI는 신경 자체의 고유우자 적 재심 특성을 활용하여 신경 근육 접합부로 의 관능 적 말단 장기 및 모터 섬유에 감각 섬유 의 회심을 장려합니다.

C-RPNI 제조는 대상 신경의 재원화 능력에 의존하기 때문에, 신경의 주의 깊은 취급은 절차 도중 가장 중요합니다. 해부 하는 동안, 대상 신경에 직접 조작 을 방지, 그리고 외상. 신경을 취급해야 하는 경우에, 대신 에피누움 또는 주변 결합 조직을 조작하는 것이 좋습니다. 우리의 실험실이 이 구조물 내의 neuroma 대형을 접하지 않더라도, 이론적으로, 중요한 신경 외상은 리스크를 증가시킬 수 있었습니다. 이 과정에서 또 다른 중요한 단계는 진피 이식...

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공개 사항

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저자는 아무런 공개가 없습니다.

감사의 글

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저자는 전문적인 기술 지원에 대한 야나 문 에게 감사드립니다. 이 논문에 제시된 연구는 SK에 R21(R21NS104584) 보조금을 통해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#15 ScalpelAspen Surgical, IncRef 371115Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic SutureEthiconSKU# 1654GP-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic SutureEthiconSKU# 687GP-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon SutureEthiconSKU# 697GP-1 Reverse Cutting Needle (나일론 봉합사)
8-0 모노 필라멘트 봉합ARO외과 용T06A08N14-13실 테이퍼 바늘에 검은 색 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합
실험용 쥐EnvigoF344-NH-sd쥐는 Fischer F344 균주
Fluriso (Isofluorane)입니다.VetOne13985-528-40흡입 마취
마스터 메카닉이 있는 고속 드릴모델 151369휴대용 회전 공구; 키트에는 여러 개의 미세한 그릿 스톤이 포함되어 있습니다.
극저온 가스UN1072표준 의료용 산소 용기
염화칼APP Pharmaceuticals63323-965-20주사 형태, 2 mEq/mL
포비돈 요오드 USPMediChoice65517-0009-110% 국소 용액, 여러 수술 준비에 한 병을 사용할 수 있습니다.
Puralube Vet Opthalmic OintmentDechra17033-211-38시술 중 사용을 위한 각막 보호 연고
Rimadyl (Caprofen)Zoetis, Inc.NADA# 141-199주사 형태, 50 mg/mL
스테레오 현미경Leica모델 M60사용자는 자신의 선호에 따라 배율을 조정할 수 있습니다
수술 기구Fine Science Tools다양한사용자는 개인 취향에 따라 또는 현재 실험실에서 사용 가능한 것 중에서 기구를 선택할 수 있습니다
중 항생제 연고MediChoice39892-0830-2연고는 멸균 가능한 일회용 패킷으로 제공됩니다
. VaporStick 3SurgivetV7015이소플루오란과 산소 용기를 위한 공간이 있는 마취 타워
Webcol 알코올 PrepCovidenRef 6818알코올 준비 물티슈; 각 준비에 새 물티슈를 사용하십시오.
사 사 마이크로 모터 스톤 산소 륨 . 삼

참고문헌

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