Method Article

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

DOI:

10.3791/60850

⸱

May 1st, 2020

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

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eIF4F 복합체의 형성은 종종 인간에서 온코겐성 활성화를 겪는 신호 경로의 수렴을 위한 핵심 다운스트림 노드로 나타났습니다. eIF4F는 변환 개시의 mRNA-리보솜 모집 단계에 관여하는 캡 결합 복합체이다. 암의 많은 세포 및 전임상 모델에서 eIF4F의 규제 완화는 암 증식 및 생존에 관여하는 특정 mRNA 하위 집합의 증가된 번역으로 이어집니다. eIF4F는 캡 결합 서브유닛 eIF4E, 헬리케이스 eIF4A 및 스캐폴딩 서브유닛 eIF4G로부터 제작된 이종트리메릭 복합체이다. 활성 eIF4F 복합체의 조립에 중요한 것은 eIF4E와 eIF4G 단백질 간의 단백질 단백질 상호 작용이다. 이 문서에서는 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용 상태를 모니터링하는 eIF4F 어셈블리를 측정하는 프로토콜을 설명합니다. eIF4e:4G 세포 기반 단백질 단백질 상호 작용 분석법은 또한 eIF4F 복합 무결성의 약물 유도된 변화가 정확하고 안정적으로 평가될 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법이 시판되는 화합물의 활성을 확인하거나 eIF4F 복합체의 형성을 효율적으로 방해하는 새로운 화합물 또는 양식의 추가 스크리닝을 위해 적용될 수 있다고 구상합니다.

Introduction

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유전자 발현의 제어는 성장 증식 및 분화와 같은 세포 프로그램의 올바른 실행에 중추적 인 역할을한다. 조절 제어 메커니즘은 유전자 전사 수준 또는 mRNA 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 지난 10 년 동안, 그것은 점점 더 분명 해지고 있다 개시 과정의 변조에 의해 번역 제어 보다는 오히려 신장 및 종료의 후반 단계 보다는 생물학적 기능의 넓은 범위를 재생 하는 단백질의 특정 하위 집합의 합성을 미세 하 게 조절할 수 있습니다.

생존에 관여하는 mRNA의 증가된 번역, 반자율적 및 반세포 반응은 여러 암에 연루되어 왔으며 또한 비정상적인 활성화 또는 번역 개시 요인1의발현에 인과 관계가 있다.

eIF4F 컴플렉스는 번역 개시의 마스터 레귤레이터입니다. mRNAs의 5'끝에 캡 구조를 결합함으로써, eIF4F는 초기 mRNA-리보솜 모집을 구동하고 차례로 약하게 번역 진핵 mRNA2의mRNA 번역 효율을 증가시키고 있다. eIF4F는 RAS/MAPK 또는 AKT/TOR 경로의 비정상적인 활성화를 수용하는 많은 암 모델에 대해 암 관련 mRNAs의 번역을 중재하여 암세포가 eIF4F를 조절하여 자체 신생물 활성....

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Protocol

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HEK293 세포주 프로토콜에 사용되었고 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포는 가습 환경에서 5% CO2로 37°C에서 배양되었다.

1. eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석등을 통한 eIF4F 복잡한 중단에 대한 정량적 평가

  1. eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석의 세포 배양 및 일시적인 연분
    1. 모든 실험에 20개 미만의 구절을 사용하여 새로 해동된 세포를 사용하십시오. 1일째에는 표준 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정하고 Trypan blue 제외방법(13)을사용하여 실행 가능한 총 셀을 계산한다.
    2. 종자 6웰 플레이트0.9 - 1.2 x 106 의 HEK 293 셀의 2 mL에서 표준 성장 배지.
      참고: 위에 표시된 세포주 내에서 최상의 경질 효율을 달성하기 위해 도금 된 세포가 시드 후 하루에 70-90 % 응수되도록하십시오.
    3. 2일 오전, SubA-eIF4E 및 eIF4G604-646-SubB플라스미드를 이용한....

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Results

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eIF4E:eIF4G604-646 보편시스템의 감도를 검증하기 위해, eIF4F 복합 조립체의 4EBP1 중재 억제는 mTOR 억제제를 사용하여 평가되었다. 4EBP 단백질 제품군의 mTORC1 키나아제 의존형 인산화를 억제함으로써, mTOR 억제는 eIF4E에 4EBP1 연결을 강화하여, 따라서 eIF4F 분해15. mTOR 키나아제의 기계적으로 다른 억제제의 두 종류는 시험되었다: 라팔로그 (예를 들어, 라파마이신) 이는 mTORC1의 알로스터 억제제이지만 mTORC2 및 ATP 경쟁 기반 억제제 (예를 들어, PP242) mTORC1 과 mTORCa 양성 활성을 모두 억제하도록 특별히 설계되었습니다.

HEK293 세포는 1단계에서 설명된 바와 같이 eIF4E:eIF4G604-646

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Discussion

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본 문서에 설명된 방법은 라이브 셀에서 eIF4G-eIF4E 상호작용의 직접 측정을 통해 eIF4F 복합 조립을 정량적으로 모니터링하기 위해 루시파라제 계 보완 분석법을 활용한다. eIF4E-eIF4G 보완 시스템의 사용에 대한 세부 정보를 제공하고 있으며, 또한 eIF4E-eIF4G 상호작용16의약물 유발 4EBP1 매개 해리를 측정하는 데 시스템이 매우 정확하다는 것을 보여주었습니다. 이 분석의 처리량을 용이하게하기 위해 이 문서에 설명된 실험 용 설정은 96 개의 마이크로 플레이트 형식 사용을 위해 설계되었습니다.

최적의 결과를 얻으려면 분석 작업을 수행할 때 두 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 실험 간의 전환 효율은 유사하게 유지되어야 합니다. 이것은 낮은 통로 수 세포의 사용을 통해 보장 될 수있다, 엄격하게 파종의 날에 세포를 계산하여. 세포 융합은 또한 DNA 형질이 수행되기 전에 평가되어야 하며, 세포 결합이 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 p53lab (BMSI, A * STAR)과 JCO VIP 보조금 (A * STAR)의 핵심 예산에 의해 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293FT 세포Thermo Fisher ScientificR70007
세포 배양 마이크로플레이트 96 well, F-Bottomgreiner bio-one655083
Cell titer Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision Multilabel ReaderPerkinElmernot applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 mlThermo Fisher Scientific4662070
Finnpipette F2 멀티채널 피펫 12채널 5-50 mlThermo Fisher Scientific4662050
FUGENE6PROMEGAE2692
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015
NanoBiT PPI 스타터 시스템PROMEGAN2014
Optimem I 감소 혈청 중앙값, 페놀 레드 없음Thermo Fisher Scientific11058021
Orbital shakerEppendorf적용 불가
&감마;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-AgaroseJena BioscienceAC-155S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., ....

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eIF4E eIF4G InteractionProtein Protein Interaction AssayLive Cell ImagingLuciferase Reporter AssaymTOR Inhibitor ScreeningHEK 293 CellsWestern Blot Analysism7GTP Pull DownCell Viability AssaySerial Dilution Protocol

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