복잡한 약 저항하는 결핵 (DR-TB) 식이요법에 환자의 준수를 분석하는 현재 방법은 부정확하고 자원 집약적 일 수 있습니다. 우리의 방법은 11 DR-TB 약물의 농도에 대한 쉽게 수집하고 저장 매트릭스, 머리를 분석합니다. LC-MS/MS를 사용하여 약물 순임을 더 잘 이해하기 위해 활용할 수 있는 하위 나노그램 약물 수준을 결정할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
약물 내성 결핵(DR-TB)은 공중 보건 위협이 증가하고 있으며 치료 약물 수준의 평가는 중요한 임상적 이점을 가질 수 있습니다. 혈장 약 수준은 현재 금 표준 평가입니다, 그러나 phlebotomy 및 감기 사슬을 요구하고, 단지 아주 최근 준수를 붙잡습니다. 우리의 방법은 모발을 사용하여, 쉽게 수집하고 장기 준수의 반사 매트릭스, 11 항 결핵 약물을 테스트합니다. 우리 그룹에 의한 이전 작업은 모발의 항 레트로 바이러스 약물 수준이 HIV 결과와 관련이 있음을 보여줍니다. DR-TB 약물에 대한 우리의 방법은 2 mg의 모발 (뿌리근에 3cm 근위)을 사용하며, 이 모발은 분쇄되어 메탄올로 추출됩니다. 샘플은 단일 LC-MS/MS 방법으로 분석되어 16분 동안 11개의 약물을 정량화합니다. 11개의 약물에 대한 정량화(LLOQs)의 하한은 0.01 ng/mg에서 1 ng/mg에 이르는 범위입니다. 샘플은 약물의 면적 비를 사용하여 정량화되고, 15N-또는 13C 표지된 약물 동위 원소 폴로그. 우리는 0.001-100 ng/mg에 이르는 교정 곡선을 사용했습니다. 직접 관찰 된 치료 (DOT)에 DR-TB 환자로부터 수집 된 모발 샘플의 편의 샘플에 대한 방법의 적용은 11 개의 약물 중 9 개의 선형 동적 범위 내에서 모발의 약물 수준을 나타내고 있습니다 (이소니아지드, 피라진아미드, 에탐부톨, 라인졸리드, 레보플록사신, 목시플로이신, 클로파지민, 베아퀴린, 프리토만). 어떤 환자도 프로티오나미드에 없었고, 에티오나미드에 대한 측정된 수준은 LLOQ에 가까웠습니다(노출 모니터링을 위한 에티오아마이드 대사산물의 적합성을 조사하는 대신 추가 작업). 요약하면, 우리는 약물 내성 결핵 치료 중 치료 약물 모니터링을위한 기술로 머리에 DR-TB 약물에 대한 다중 타액 화 패널의 개발을 설명합니다.
서론
21 세기에, 약 저항하는 결핵 (DR-TB)는 이미 약한 국가 결핵 통제 프로그램에 대한 진화하는 재앙입니다, 확인된 케이스는 전 세계적으로 항균 저항과 관련있는 모든 죽음의 거의 1/3을 차지하는, 지난 5 년 에서만 두 배로,1,,2. DR-TB의 성공적인 치료는 약물 에 민감한 결핵에 대한 치료보다 전통적으로 더 길고 독성이 있는 2차 처방이 요구되고 있다. 더욱이, DR-TB를 가진 환자는 수시로 저항의 출현에 처음에 기여한 준수에 중요한 기존 도전이있습니다 3.
바이러스 성 부하가 처리를 감시하기 위하여 이용될 수 있는 HIV 감염과는 달리, 결핵에 있는 처리 반응의 대리 종점은 개별 수준4에연기되고 믿을 수 없습니다. 환자 준수를 모니터링, 하위 치료 항 결핵 약물 농도 및 치료 실패의 중요한 예측, 또한 도전이다. 자체보고 준수는 리콜 편견과공급자를기쁘게하는 욕망에서 고통5,6. 알약 수 및 약물 치료 이벤트 모니터링 시스템 (MEMS)....
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프로토콜
모든 환자는 모발 샘플 수집 전에 서면 으로 통보된 동의를 제공했습니다. 우리는 케이프 타운 대학과 캘리포니아 대학, 샌프란시스코에서 기관 검토 위원회의 승인을 얻었다.
1. 모발 샘플링
- 서면 으로 동의를 얻으십시오.
- 깨끗한 가위를 사용하여 후두 부위에서 약 20-30 개의 두피 모발 가닥을 가능한 한 두피에 가깝게 자른다.
- 방향성을 나타내기 위해 머리카락의 말단 주위에 테이프를 놓습니다. 모발 샘플을 알루미늄 호일 정사각형으로 접고 실온에서 보관하십시오. 모발의 말단에 라벨을 붙이면 근위쪽 끝의 추가 취급으로 인한 오염가능성을 방지합니다.
- 환자 샘플 외에도 결핵 약을 복용하지 않은 사람으로부터 두피 모발 샘플인 "빈 모발"을 수집합니다. 다량 (각 20 명의 환자 샘플에 대해 30 mg의 빈 머리카락)을 수집합니다.
2. 약물 추출
- 비드 튜브에 레이블을 지정합니다. 각 환자 샘플에는 하나의 튜브가 필요합니다. "C0"에서 "C11"까지 12개의 튜브를 레이블로 지정하고 각 12개의 교정 지점에 대해 하나씩 레이블을 지정합니다. 저품질 관리를 위한 튜브, 중간 품질 관리를 위한 튜브 및 고품질 ....
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결과
모든 11 DR-TB 약물의 확인 된 수준을 가진 크로마토그램의 그림은 그림 1에나와 있습니다. 각 측정기와 컬럼을 사용할 때 각 측정기의 보존 시간이 변경될 수 있으므로 정확한 보존 시간은 개별적으로 결정해야 합니다.
캘리브레이터 중 하나(DR-TB 약물 기준로 스파이크된 빈 모발 샘플) 중 하나에 대한 특정 약물(이소니아지드, INH)에 대한 추출된 이온 크로마토그램(EIC)은 도 2에나타내었다. 정량자 및 한정자 전이는 정성적 약물의 존재를 확인하는 데 사용됩니다, 수량체의 영역과 한정자의 영역 사이의 비율은 샘플에 걸쳐 일정하게 유지로. 또한 내부 표준을 모니터링하여 각 샘플 주입이 정규화되도록 합니다.
데모를 위해 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에서 DR-TB 약물을 복용한 96명의 총 연구 집단 중 15개의 모발 .......
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토론
우리는 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 DR-TB 치료에 활용된 11가지 항결핵 약물을 정량화하기 위해 개발하고 검증한 방법에 대한 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 모발에 있는 이 11개의 약을 정량화하는 그밖 방법은 이전에 개발되고, 검증되고 간행되었습니다. 우리의 방법은 약 3 센티미터 (cm)의 약 20-30 머리 가닥에서 약물의 하위 나노 그램 수준을 정량화 할 수 있으며 이미22mg이 검증되었습니다. 분석된 머리의 낮은 무게는 연구 결과에 관련시킨 환자가 대머리 두피를 노출의 두려움 없이 반복 시험을 위해 신중하게 잠재적으로 돌아올 수 있다는 것을 의미합니다. 우리는 이전에 머리와 DR 처리 결과에 있는 DR-TB 약 수준 사이 협회에 데이터를 간행했습니다23. 따라서, 이러한 다중-매해 패널 방법의 개발 및 검증은 DR-TB 치료 약물 모니터링 분야에서 상당한 진전을 나타낸다.
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공개 사항
이 작품은 국립 알레르기 및 전염병 연구소 RO1 AI123024 (공동 파이 : 존 멧칼프와 모니카 간디)에 의해 지원되었다.
감사의 글
저자는 케이프 타운 폐 연구소의 대학에서 키에르탄 Dheda 교수, 알리 에스마일 박사, 마리에지 프레토리우스 에게 감사하고 싶습니다 연구를위한 모발 샘플의 수집을 촉진. 저자는 이 연구 참가자들의 기여를 더욱 감사하게 인정한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 주사 바이알 | 애질런트 테크놀로지스 | 5182-0716 | |
| 250 uL 주입 바이알 인서트 | 애질런트 테크놀로지스 | 5181-8872 | |
| 비드 러프터 24 | 옴니 인터내셔널 | 19001 | |
| 비드 파열관 (2 mL 비드 키트, 2.8mm 세라믹, 2 mL 마이크로튜브) | 옴니 인터내셔널 | 19628 | |
| 베다퀼린 | 토론토 리서치 케미컬 | B119550 | |
| 베다퀼린-d6 | 토론토 리서치 케미컬 | B119552 | |
| 클로파지민 | 토론토 리서치 케미컬 | C324300 | |
| 클로파지민-d7 | 토론토 리서치 케미컬 | C324302 | |
| 일회용 석회유리 배양관 | VWR | 60825-425 | |
| 에탐부톨 | 토론토 리서치 케미컬 | E889800 | |
| 에탐부톨-d4 | 토론토 리서치 케미컬 | E889802 | |
| 에티오나마이드 | 토론토 리서치 케미컬 | E890420 | |
| 에티오나마이드-d5 | 클리어신스 | CS-O-06597 | |
| 개미산 | 시그마-올드리치 | F0507-100mL | |
| 유리병 | 코 닝 | 1395-1L | |
| 핫 셰이커 | 벨코 글래스 주식회사 | 7746-32110 | |
| HPLC | 애질런트 테크놀로지스 | 인피니티 1260 | |
| HPLC 등급 아세토니트릴 | 니 웰 | 015-4 | |
| HPLC 등급 메탄올 | 니 웰 | 230-1L | |
| HPLC 등급 물 | 아쿠아 솔루션즈 주식회사 | W1089-4L | |
| 이소니아지드 | 토론토 리서치 케미컬 | I821450 | |
| 이소니아지드-d4 | 토론토 리서치 케미컬 | I821452 | |
| LC 기둥, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | 현상 | 00D-4371-B0 | |
| LC 가드 카트리지 | 현상 | AJ0-8788 | |
| LC 가드 카트리지 홀더 | 현상 | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS 정량 소프트웨어 | 사이엑스 | 멀티퀀트 2.1 | |
| 레보플록사신 | 시그마-올드리치 | 1362103-200MG | |
| 레보플록사신-d8 | 토론토 리서치 케미컬 | L360002 | |
| 리네졸리드 | 토론토 리서치 케미컬 | L466500 | |
| 리네졸리드-d3 | 토론토 리서치 케미컬 | L466502 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | E& K 사이언티픽 | 695554 | |
| 목시플록사신 | 토론토 리서치 케미컬 | M745000 | |
| 목시플록사신-13C, d3 | 토론토 리서치 케미컬 | M745003 | |
| MS/MS | 사이엑스 | 트리플 쿼드 5500 | |
| OPC 14714 | 토론토 리서치 케미컬 | O667600 | |
| 프레토마니드 (PA-824) | 토론토 리서치 케미컬 | P122500 | |
| 프로티오나마이드 | 토론토 리서치 케미컬 | P839100 | |
| 프로티오나마이드-d5 | 토론토 리서치 케미컬 | P839102 | |
| 피라진아마이드 | 토론토 리서치 케미컬 | P840600 | |
| 피라지나마이드-15N, d3 | 토론토 리서치 케미컬 | P840602 | |
| 주사 바이알용 격격 캡 | 애질런트 테크놀로지스 | 5185-5862 | |
| 터보팹 LV 증발기 | 생물산 | 103198/11 |
참고문헌
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Pre....
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