opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.
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방법 논문
바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
opsono 준수 분석법은 전문 식세포에 세균성 병원체의 부착을 열거하는 기능성 분석입니다. 준수는 phagocytosis와 살인에 필수이기 때문에, 분석법은 opsono-phagocytic 살인 분석의 대안 방법입니다. opsono 준수 분석의 장점은 여러 실험에 걸쳐 표준화를 허용하는 불활성화 된 병원체 및 포유류 세포주를 사용하는 옵션입니다. 분석에서 불활성화 된 병원체의 사용은 또한 생물 안전 수준 3 전염성 요원 및 기타 악성 병원균과 함께 작동을 용이하게합니다. 우리의 작업에서, opsono 준수 분석체는 탄저병 캡슐 기지를 둔 백신으로 면역화된 동물의 세라로부터 항체의 기능적 능력을 평가하기 위해 사용되었으며, 고정 된 바실러스 탄트라시스의 부착을 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 유도하는 데 사용되었습니다. 자동 형광 현미경 검사는 대식세포에 고부딩하는 바실리의 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 증가된 준수는 혈청에 있는 항체 항체의 존재와 상관관계가 있었다. 높은 혈청 항체 항체 농도를 전시한 비인간 영장류는 탄탈병 도전으로부터 보호되었다. 따라서, opsono-준수 분석체는 세라에서 항원 특이적 항체의 생물학적 기능을 해명하고, 백신 후보 및 기타 치료제의 효능을 평가하고, 면역의 가능한 상관관계로서 작용할 수 있다.
서론
병원체의 인식, 준수, 내재화 및 분해는 1883년 일리아 메치니코프가 처음 기술한 숙주 인내 면역 반응에서 현저한 통로인식세포증1,3에 필수적이다. 면역 계통의 그밖 세포뿐만 아니라 식세포 백혈구는 표적의 그들의 선택에 있는 높게 차별적입니다; 그들은 패턴 인식 수용체 (PRR)4,5의레퍼토리에 의해 병원균 관련 분자 패턴을 통해 "전염성 비 자기"와 "비 감염성 자아"를 구별 할 수 있습니다. 병원체의 숙주 인식은 또한 보완 및 항체6과같은 숙주 opsonins의 결합으로 발생할 수 있다. opsonization에게 불린 이 프로세스는, phagocytic 세포에 opsonic 수용체 (예를 들면, 보충 및 Fc 수용체)에 결합시 내성을 강화하는 이 분자로 병원체를 코팅합니다6. 병원체가 식세포에 부착하려면, 그들의 cognate 리간드와 다중 수용체의 집단 결합이 필요하다. 그런 다음에야 내산화6을 시작하기 위해 호스트 셀 내부의 신호 캐스케이드를 트리....
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프로토콜
동물 복지법, 공중 보건 서비스 정책 및 동물과 관련된 기타 연방 법령 및 규정에 따라 여기에 설명 된 연구는 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구가 수행 된 시설은 국제 실험실 동물 관리협회의 인증을 받았으며 실험실 동물의 치료 및 사용 가이드, 국립 연구 위원회, 201124에명시된 원칙을 준수합니다.
1. 세포주 배양 및 유지 보수, RAW 264.7
참고: 무균 기술로 다음 절차를 수행해야 합니다.
- 56°C 수조에서 태아 소 혈청(FBS)을 30분 동안 가열하여 보완합니다.
참고: FBS가 56°C에 도달하면 30분의 비활성화 시간이 시작됩니다. 온도를 모니터링하려면 동일한 수조의 비커에 비슷한 양의 물을 가열합니다. 물이 56°C에 도달하면 FBS에 대한 30분 카운트다운을 시작합니다. 또는 열 비활성화된 FBS도 시판됩니다. - 90% DMEM과 높은 포도당 및 10% 열 비활성화 FBS(v/v)를 결합하여 RAW 264.7 세포에 대한 배지를 준비한다. L-글루타민을 6mM의 최종 농도에 추가합니다.
참고 : 높은 포도당DMEM은 4 mM L-글루타민으로 ....
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결과
이 섹션은 OAA가 항체의 생물학적 기능을 검사하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 결과와 함께 OAA 실험 중에 수집된 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 여기서, 분석은 탄집병 백신 후보의 효능을 평가하기 위해 성공적으로 사용되었다. 캡슐화가 거의 또는 전혀 캡슐화되지 않아 숙주 세포를 고수하여 높은 배경을 생성하는 바실리에 캡슐화 상태를 확인하는 것이 중요합니다. 도 1은 캡슐화를 검사하기 위해 인도 잉크로 부정적으로 염색한 B. 탄트라시스 에임스의 이미지입니다. OAA는 여러 개의 인접 한 시야 필드를 조명하고 공초점 현미경 검사를 사용하는 경우 여러 스택 또는 단면을 필요로합니다. 따라서, 바실리가 너무 어둡거나 사진 표백제도 너무 빨리 인지 확인해야 합니다. 도 2는 FITC로 표시된 바실리의 이미지입니다. 도 3은 세포 단층층에 부착된 .......
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토론
캡슐 계 백신은 수많은 세균 성 병원균에 대해 효과적인 것으로 나타났으며, 많은 사람들이 인간25,26,27에서사용하기 위해 허가된다. 이들 백신은 캡슐을 표적으로 하는 항체를 생성함으로써 작용하며 이들 연구의 대부분은 OPKA를 사용하여 항체13,14, 16,28,29의opsono-phagocytic 기능을 나타내고 있다. 생물 안전 문제와 작업 용이성으로 인해 B. 탄트라시스 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 동물의 항체를 평가하기 위한 OAA를 개발했습니다........
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공개 사항
저자는 이해 상충을 야기할 수 있는 상업적 또는 기타 협회가 없습니다.
감사의 글
J. 추아, D. 차봇, A. 프리들랜더는 원고에 설명된 절차를 설계했다. J. 추아와 T. 퍼트몬 테일러는 실험을 수행했다. D. Chabot은 데이터 분석을 수행했습니다. 제이 추아는 원고를 썼다.
저자는 우수한 기술 지원을 카일 J. Fitts 감사합니다.
이 작업은 국방 위협 감소 국 보조금 CBM에 의해 지원되었다. VAXBT.03.10.RD.015, 계획 번호 921175.
의견, 해석, 결론 및 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 이 출판물의 내용은 반드시 국방부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급은 미국 정부의 지지를 의미하지도 않습니다.
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재료
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| 0.20 & 마이크로; m 주사기 필터 (25mm, 재생 셀룰로오스) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL 주사기 (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75cm sq. 조직 배양 처리 플라스크 | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| 한천 (분말) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
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| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) 플레이트 | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 웰 세포 배양 플레이트 (희석용 플레이트 #2 & 3) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고혈당 | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | 에는 4500mg/L 포도당, 4mM L-글루타민, 페놀 레드 |
| EVOS FL 자동 세포 이미징 시스템(형광 현미경) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
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| 슬라이드 | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
참고문헌
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoolo....
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