Method Article

시험을 위해 불완전하게 절제술된 연조직 육종의 마우스 모델(Neo) 보조 요법

DOI:

10.3791/60882

⸱

July 28th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3College of Science, Health, Engineering and Education, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서, 우리는 테스트 (네오) 보조 요법을위한 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수술은 종종 많은 고형 종양에 대한 첫 번째 치료입니다. 그러나, 국소 재발은 보조 또는 신 보조 요법에도 불구하고 1 차적인 종양 절제술 다음 수시로 생깁니다. 이것은 외과 마진이 불충분하게 종양이 없는 때, 잔류암세포의 결과로 생깁니다. 생물학적 및 면역학적 관점에서 수술은 무효 이벤트가 아닙니다. 상처 치유 환경은 프로 종양 유발 경로를 유도하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로, 국소 재발방지를 위한 약물 개발을 위한 전임상 모델은 새로운 (neo) 보조 요법을 테스트할 때 외과 적 절제술을 통합하여 수술로 치료받은 환자의 임상 설정을 모델링해야 합니다.

여기서, 우리는 상처 치유 반응의 설정에서 (네오) 보조 요법의 테스트를 허용하는 WEHI 164 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델에서는 종양의 50% 또는 75%가 제거되어 임상 환경에서 수술 후 총 잔류 질환을 모델링하기 위해 일부 암 조직을 남겨두고 있습니다. 이 모델은 또한 상처 치유 반응을 고려하는 동안 수술의 맥락에서 치료를 테스트 할 수 있습니다, 이는 (네오) 보조 치료의 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 불완전한 외과 절제술은 보조 요법의 부재에 있는 모든 마우스에 있는 종양의 재현가능한 재생결과. 체크포인트 봉쇄를 가진 보조 치료는 감소된 종양 재성장을 초래합니다. 이 모형은 이렇게 수술 및 그것의 관련인된 상처 치유 반응의 맥락에서 치료를 시험하기 위하여 적적합하고 고형암의 그밖 모형으로 확장될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수술은 연조직 육종2,3을포함하여 많은 고형 종양1에대한 주요 치료 옵션으로 남아 있다., 암 수술 기술의 개선에도 불구하고(neo)보조 요법과의 조합, 1차 종양 절제술4,,5에이어 암 재발 및 전이의 위험이 여전히 높다. 연조직 육종에서는 재발이 수술 현장에서 특히 로코리토리적으로 발생하여 이환율과 사망률이 증가합니다. 임상 설정에서, 충분한 마진(예를 들어, 해부학적 제약으로 인한)을 얻기 어려울 수 있으며, 불완전한 절제술과 후속 종양 재발6의결과로. 수술적 스트레스와 상처 치유의 후속 과정은 종양 재발에 유리한 면역 억제 종양 미세 환경을 조성하는 것으로 알려져 있다7,,8. 따라서 연조직 육종, 특히 면역 요법을 위한 새로운 치료법의 발견 및 개발은 외과 적 상처 치유 반응을 이상적으로 고려해야합니다.

보조 요법에 대한 대부분의 전임상 ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 실험에 사용된 동물은 동물 자원 센터 (퍼스, 웨스턴 오스트레일리아)에서 수득되었다. 동물은 의학 연구 생물 자원 노스 시설의 해리 퍼킨스 연구소 (퍼스, 웨스턴 오스트레일리아)에서 표준 병원체없는 조건하에서 유지되었다. 모든 실험은 의학 연구 동물 윤리위원회의 해리 퍼킨스 연구소에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 이 실험에서 8-12주 생의 BALB/c 마우스가 사용하였다. WEHI 164 섬유육종 세포주체는 셀뱅크 오스트레일리아(웨스트미드, 뉴사우스웨일즈)로부터 입수되었다.

1. 세포의 접종

  1. 세포와 동물의 준비
    1. 셀라인이 권장 된 매체에서 유지되는지 확인합니다. 예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지에서 WEHI 164 세포주를 유지하여 2mM L-글루타민, 10% 태아소 세럼, 20mMHEPES, 0.05mMMMMMMMM, 0.05mMMM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/stl/ml.ml.ml.을 유지합니다.
      참고: 극저온 저장에서 제거된 후 적어도 3회 및 최대 5회 까지의 통로 세포. 최적의 세포 생존가능성을 보장하기 위해 70-80% 컨할 때 세포를 분할해야 합니다. 종양 세포주 마이코플라즈마에 대 한 테스트 해야....

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Results

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50mm2의 크기로 종양 성장은 부분 해독에 이상적인 크기이다. 50mm2 종양의 불완전한 외과 절제술은 보조 면역 요법(도 4A)이없는경우 종양의 100 % (n =5) 재현 가능한 재성장을 초래합니다. 우리는 다음으로 검사점 분자 Cyto독성 T 림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4) 및 프로그램 된 죽음 수용체 1 (PD-1)에 대한 항체를 사용하여 보조 면역 요법을 테스트하기 위해 모델을 사용했다. 항 CTLA-4 또는 항-PD-1을 가진 마우스의 처리는 각각(도 4B, 4C)의치료 비율 80% 및 25%(군당 n=4-5)의 치료율을 초래하였다. 안티 PD-1의 응답은 새로운 조합을 테스트하여 응답률을 더욱 향상시킬 수 있는 기회를 제공합니다.

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Discussion

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우리는 peri 수술 치료를 테스트하기 위해 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 치료 다음 마우스 사이 상처 치유의 평가를 허용 하기 위해 수술 절개를 표준화.

종양 배치는 이 프로토콜의 중요한 부분입니다. 우리는 마우스에 최소한의 부담으로 종양 부위에 쉽게 수술 및 투여를 허용하는 피하 종양 모델을 선택했습니다. 종양이 피하 공간에서 자라지 않고 복막 내에 있지 않게 자라도록 하는 것도 중요하며, 이는 예기치 않은 이환율과 사망률을 초래할 수 있습니다.

이 프로토콜에 대한 종양 세포줄을 선택할 때, 우리는 세포가 생체 내에서 성장할 때 반고체 질량(예를 들어, WEHI-164 모델)을 형성하는 것이 기술적으로 부분적으로 절제하기 어렵기 때문에 반고체 질량(예를 들어, WEHI-164 모델)을 형성하는 것이 좋습니다. 또한 종양이 피부를 통해 성장하기 시작하면 (일반적으로 .......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 육종에 양말에서 보조금에 의해 지원됩니다! 재단, 오스트레일리아 및 뉴질랜드 육종 협회, 어린이 백혈병 및 암 연구 재단 및 영구 자선 단체. W.J.L은 사이먼 리 펠로우십과 국립 보건 의료 연구 위원회, 암 위원회 WA의 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
26 게이지 0.5 mL 인슐린 주사기Becton Dickinson, 호주326769없음
2-MercaptoethanolLife Technologies Australia Pty Ltd21985023없음
마취 가스 기계Darvall Vet, 호주SKU: 2848없음
Anti-CTLA-4BioXcell, 미국BE0164없음
Anti-PD-1BioXcell, 미국BP0273없음
부프레노르핀 염산염 주사, 0.3mg/mLRB 헬스케어 UK Limited, UK55175처방전 주문
클로르헥시딘 수술용 스크럽 4%Perigo Australia, AustraliaCHL01449F(스크럽없음
태아 소 혈청CellSera, 호주AU-FBS-PG없음
집게 미세 10.5cm외과 하우스, 서호주CC74110없음
집게 미세 12cm 톱니 모양의수술 집, 서호주CC74212없음
집게 Halsted 14cm외과 집, 서호주CD01114없음
가열 챔버Datesand Ltd, 영국미니 온도계없음
HEPES (1M)Life Technologies Australia Pty Ltd15630080없음
IsofluraneHenry Schein Animal Health, AustraliaSKU: 29405처방전 주문
윤활 눈 연고Alconn/a없음
페니실린/스트렙토마이신 1000XLife Technologies Australia Pty Ltd15140122없음
인산염 완충 용액 10xLife Technologies Australia Pty Ltd70013-032없음
Reflex 7mm 클립가능 과학적, 호주AS59038없음
반사 7mm 상처 클립 어플리케이터에이블 과학, 호주AS59036없음
반사 상처 클립 제거기에이블 과학적, 호주AS59037없음
설치류 Qube 마취 호흡 회로Darvall Vet, 호주#7885없음
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 중간 + L-글루타민Life Technologies Australia Pty Ltd21870092없음
가위 Iris STR 11cm수술 하우스, 웨스턴 오스트레일리아KF3211없음
가위 Iris STR 9cm수술 하우스, 웨스턴 오스트레일리아JH4209없음
소형 유도 챔버Darvall Vet, 호주SKU: 9630없음
TrypLE 익스프레스 1xLife Technologies Australia Pty Ltd12604-021없음
Germinator 500 유리 구슬 살균기Cellpoint Scientific Inc., USA5-1460-DK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686(2018).
  2. Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36<....

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Soft Tissue SarcomaMouse ModelIncomplete ResectionTumor DebulkingWound HealingAdjuvant TherapyCheckpoint BlockadeAnti CTLA 4Anti PD 1Flow Cytometry

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