이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
지질 나노튜브(LNT) 네트워크는 진핵 세포에서 발견되는 유비쿼터스 지질 세관과 관련성이 있는 분자 수송 및 지질 생물물리학을 연구하기 위한 시험관내 모델 시스템을 나타낸다. 그러나 생체 내 LNT는 화학 에너지와 분자 모터를 조립, 유지 및 재구성해야하는 매우 비평형 구조입니다. 또한, 생체내 LNTs의 조성은 다수의 상이한 지질 종들로 구성된 복합체이다. LNT를 압출하는 일반적인 방법은 시간과 노동 집약적이며, 거대한 지질 소포에서 나노 튜브를 강제로 끌어 오기 위해 광학 핀셋, 마이크로 비드 및 마이크로 피펫이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을위한 프로토콜이며, 대규모 LNT 네트워크는 키네신 구동 미세 소관 운동성을 사용하여 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)에서 빠르게 생성됩니다. 이 방법을 사용하여, LNT 네트워크는 생물학적 LNT의 복잡성을 모방하는 광범위한 지질 제형으로 형성되어, 지질 생물물리학 및 막 관련 수송의 시험관내 연구에 점점 더 유용하게 된다. 또한이 방법은 일반적으로 사용되는 실험실 장비를 사용하여 단시간 (<30 분) 내에 LNT 네트워크를 안정적으로 생산할 수 있습니다. 길이, 폭 및 지질 분할과 같은 LNT 네트워크 특성도 네트워크 제조에 사용되는 GUV의 지질 구성을 변경하여 조정할 수 있습니다.
서론
지질 나노튜브(LNT) 네트워크의 제작은 비평형 지질 구조 1,2,3의 시험관내 검사에 대한 관심이 증가하고 있다. 세포는 단백질(4)과 핵산(5)의 확산 수송뿐만 아니라 세포-세포간 통신(6,7)을 위해 지질 세관을 사용한다. 소포체 및 골지 장치는 특히 흥미로운데, 이러한 막-결합된 소기관은 지질 및 단백질 합성을 위한 주요 위치일 뿐만 아니라 세포의 세포질 내에서 이들 필수적인 생체분자의 수송을 위한 주요 위치이기 때문이다8,9. 이들 소기관의 막은 궁극적으로 그들의 기능을 정의하는 데 도움이 되는 스핑고지질, 콜레스테롤 및 인지질(10)을 포함하는 다수의 지질 종으로 구성된다. 따라서, 이들 소기관을 보다 밀접하게 복제하고 연구하기 위해, 시험관내 LNT는 점점 더 복잡한 지질 제형
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프로토콜
1. 재고 미세소관 용액의 제조
주의: 안전 고글, 장갑 및 실험실 코트는 항상 프로토콜 전체에서 착용해야 합니다.
- 5x BRB80 버퍼를 준비하십시오: 24.19 g의 파이프(피페라진-N,N'-비스[2-에탄설폰산])와 0.38g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스[β-아미노에틸 에테르]-N,N,N',N'-테트라아세트산)를 1L 유리 병에 넣으십시오. 1 mL의 1 MMgCl2 를 첨가하고, KOH로 pH를 6.9로 조정하였다. 탈이온수를 첨가하여 용액을 500 mL의 최종 부피로 가져온다.
- GTP 용액의 100 mM 스톡을 준비하십시오 : GTP 52mg을 칭량하고 증류수 1 mL에 현탁하십시오. 100 mM 용액을 20 μL 분취량으로 나누고 -20°C에서 보관한다.
- GPEM 용액을 준비하십시오: 200 μL의 5x BRB80, 100 mM GTP 용액 10 μL, 100 μL의 100% 글리세롤 및 600 μL의 탈이온수를 혼합한다. GPEM 용액을 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에 보관한다.
- 차가운 (4 °C) GPEM 용액에서 상업적으로 입수가능하고 동결 건조 된 튜불린 (비오티닐화, 형광 표지 및 비표지 된 바이알)의 바이알을 5 mg ....
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결과
LNT 네트워크(그림 4)는 GUV로부터 LNT를 밀어내기 위해 미세소관의 키네신 수송에 의해 수행된 작업을 사용하는 설명된 프로토콜을 사용하여 제작되었다. 간략하게, GUVs는 수크로오스 용액을 사용하여 재수화된 아가로스 겔을 사용하여 제조되었고, 미세소관은 GPEM 용액에서 중합되고 BRB80T에서 안정화되었다. 다음으로, kinesin 모터를 유동 셀에 도입하여 커버슬립 표면에 모터의 활성 층을 형성했습니다. 그런 다음 미세소관을 도입하고 스트렙타비딘 용액을 첨가하여 비오티닐화 지질과 GUV (이후 도입됨) 간의 결합을 촉진시켰다.
유동 전지에 존재하는 모든 성분들과 함께, LNT들은 30분 동안 형성되도록 허용되었고, 이 시점에서 AMP-PNP는 운동성을 멈추기 위해 도입되었다. 이어서, LNTs를 100x 오일 목표를 사용하여 에피형광 현미경으로 이미지화하였다. LNT는 상당히 클 수 있습니다. 따라서, 더 낮은 동력.......
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토론
LNT 네트워크는 막횡단 단백질과 같은 생체분자의 특성 및 수송에 대한 시험관내 연구에 유용한 도구이다. 또한, LNT 네트워크를 제조하기 위해 복잡한 지질 제제를 사용하는 것은 생물학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 한다. 다른 제조 연구는 1) 단순 지질 제제 및 다중 라멜라 소포 또는 2) 복잡한 지질 제형으로 구성된 GUV의 네트워크를 제조하기 위해보다 성가신 운동성 기술을 사용했습니다. 여기에 설명 된 방법은 복잡한 지질 제제 및 GUV에서 대규모 LNT 네트워크를 효율적으로 제작하고 저렴한 시약 및 장비를 사용하여 가능하게합니다. 따라서이 방법론은 상 분리 및 막 단백질 수송을 포함한 다양한 생물학적 과정을 연구 할 수있는 능력을 제공합니다. 상기 프로토콜은 LNT들의 조성이 그들의 생물학적 유사체들(예를 들어, 골지 장치)에 근사하도록 최적으로 조정될 수 있는 시험관내 모델을 사용한다.
여기에 설명된 방법에서 LNT 네트워크의 형성은 수많은 이점을 갖는다. 예.......
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공개 사항
Sandia National Laboratories는 DE-NA-0003525 계약에 따라 미국 DOE의 국가 핵 안보국을 위해 Honeywell International, Inc.의 전액 출자 자회사 인 Sandia, LLC.의 National Technology & Engineering Solutions가 관리하고 운영하는 다중 임무 실험실입니다. 이 백서에서는 객관적인 기술적 결과 및 분석에 대해 설명합니다. 논문에서 표현 될 수있는 주관적인 견해 나 의견이 반드시 미국 에너지부 또는 미국 정부의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
감사의 글
이 작업은 미국 에너지부, 기본 에너지 과학 사무소, 재료 과학 및 엔지니어링 부서 (BES-MSE)의 지원을 받았습니다. Kinesin 합성 및 형광 현미경 검사는 미국 에너지부 (DOE) 과학 사무소에서 운영되는 과학 사용자 시설 인 통합 나노 기술 센터 (Center for Integrated Nanotechnologies)의 사용자 프로젝트 (ZIM)를 통해 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100x/1.4 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈 | 올림푸스 | 1-U2B836 | 올림푸스 UPlanSApo 100x/1.40 오일 대물렌즈 무한대 보정, RMS 스레드 작동 거리 0.12mm |
| 3.0 ND 필터 | 올림푸스 | 중성 밀도 필터 | |
| AMP-PNP | 시그마-알드리치 | A2647 | (&베타;,&감마;-이미도아데노신 5&프라임;-트리포스페이트) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | 아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물 BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 필터 세트 | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel 필터 세트, DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 및 기타 LED 기반 광원으로 조명되는 형광단 |
| 인 | 시그마-알드리치 | 22090 | 미생물학용 카세인 가수분해물 |
| 카탈라아제 | 시그마-알드리치 | C9322 | 소의 카탈라제 |
| 클로로포름 | 시그마-알드리치 | 288306 | 클로로포름 무수 안정제로 0.5-1.0% 에탄올 함유 |
| 콜레스테롤 | 아반티 | 700000P | 콜레스테롤 (양모, >98 %) (분말) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+) - 포도당 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합, 곤충 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, ≥ 99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (클로로포름) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (분말) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol 용액 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Aspergillus niger 유형 II에서 포도당 산화효소, ≥ 10,000 units/g 고체(산소 첨가 제외) |
| 글리세롤 | Fisher | G33 | 글리세롤(ACS 인증), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | 구아노신 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus 현미경 | Olympus | N/A | IX81 Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium 수산화물 |
| 염화마그네슘 | 시그마-알드리치 | M1028 | 1.00 M 염화마그네슘 용액 |
| 오르카 플래시 4.0 디지털 카메라 | 하마마츠 | C13440-20CU | ORCA-플래시 4.0 V3 디지털 CMOS 카메라 |
| 오레곤 그린-DHPE | 인비트로젠 | O12650 | 오레곤 그린 488 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 |
| 파클리탁셀 | 써모피셔 | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - 연구 전용으로 사용 |
| PIPES Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | 시그마-알드리치 | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
참고문헌
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D.
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