본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
중추 신경계에서 올리고엔드로시트는 축삭 수초화에서 자신의 역할로 잘 알려져 있으며, 이는 염전을 통해 행동 잠재력의 전파를 가속화합니다. 더욱이, 보고의 증가 수는 oligodendrocytes가 특히 가용성 요인의 분비를 통해, myelination를 넘어 뉴런과 상호 작용한다는 것을 건의합니다. 여기에서, 우리는 또한 성상 세포 및 microglial 세포를 포함하는 신경교 세포 배양에서 oligodendroglial 계보 세포의 정제를 허용하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 37 °C에서 하룻밤 흔들림에 의존, 이는 오버 리올리고겐드로글리알 세포와 미세 교만 세포의 선택적 분리를 허용, 차등 접착에 의해 미세 글리아의 제거. 그런 다음 올리고엔드로시트의 문화와 올리고엔드로시테(oligodendrocyte) 조절 배지(OCM)의 생산을 설명합니다. 우리는 또한 공동 문화 실험에서 정제 된 해마 뉴런에 추가 된 OCM 치료 또는 올리고 덴 드 로시테의 역학을 제공, 올리고 덴 드 로시테 - 뉴런 상호 작용을 연구.
서론
올리고엔드로시트(OLs)는 축삭 주위의 미엘린을 생성하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포이다. 올Ls는 배아 CNS의 심실 영역 내에서 증식한 후 완전히 성숙한 올(즉, 미엘린 형성 세포)로 이동하고 분화하는 올리고엔드로시테 전구체 세포(OPCs)에서 유래합니다1. OPCs는 초기 발달 도중 풍부합니다, 그러나 또한 중요한 증식 세포 인구를 대표하는 성인 두뇌에서 지속합니다2. 하나의 OL은 흥분되지 않는 단면(즉, 인터노드)에서 다중 축삭을 ensheathes하고, 각 myelin 루프의 가장자리는 미엘린1,3의절연 특성에 중요한 편집증 도메인을 형성하는 축삭에 부착된다. 파라노드 사이에는 Ranvier의 노드라고 불리는 작은 미수화 된 간격이 있습니다. 이러한 노드는 전압 게이트 나트륨 채널 (Nav)이 풍부하여 염전도4를통해 작용 전위를 재생하고 신속하게 전파 할 수 있습니다. 이 단단한 상호 작용은 또한 OLs5,6에서젖산의 신경 관내 섭취를 통해 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 실험에서 쥐의 관리 및 사용은 기관 정책 및 지침 (UPMC, INSERM 및 유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)을 준수합니다. 다음 프로토콜은 12 개의 새끼의 표준 쓰레기에 대해 설정됩니다.
1. 플라스크 준비 (~5 분)
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 해부 전날 다음 단계를 수행하십시오.
- 폴리에틸렌민 5 mL(PEI, 100 mg/L, 보충 파일 1의프로토콜 참조)을 사용하여 필터 캡(2개 새끼용 플라스크 1개)으로 150 cm2 플라스크(T150)를 코팅합니다.
- 플라스크를 밤새 4°C에서 보관합니다.
- 해부 당일 멸균 증류수로 플라스크를 3회 헹구어 줍니다.
2. 미디어 준비 (~10분)
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
- 500 mL의 배양 배지를 준비, DULbecco의 수정 된 독수리 매체로 구성 (DMEM) 보충 10% 태아 송아지 혈 청의 (FCS) 그리고 페니실린-스트렙토 마이신 (100 IU/mL).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 프로토콜에서, OL 혈통 세포는 성상 세포 및 마이크로 글리아를 흔들어 신경교 배양물로부터 정제된다. OL 배양물의 순도 및 자형질 검사는 신경교 마커15로면역 염색함으로써 평가될 수 있다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, OL 배양액은O4+세포의 90% ±4%, 85% ±7%NG2+ 세포, 4.7% ±2.1%PLP+ 세포의 경우, 7.2% ±2.5%의 세포가GFAP+ 성상세포(평균 ±S.D., n;3;3)를 가진 것으로 나타났다. 그림 2). 또한, 4.6% ±0.7% 세포의 CD11b+ 미세교세포(평균±S.D., 도시되지 않음)를 하였다.
이러한 배양물로부터 생.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기서, 우리는 혼합 신경교 배양으로부터 고도로 농축된 올리고덴드로글리알 계보 세포 배양체를 얻기 위한 상세한 프로토콜을 제공하며, 이전에 발표된 방법16으로부터적응하고, OL-컨디셔닝 배지의 후속 생산을 제공한다. 이러한 흔들림 기술은 비용이 많이 들이지 않고, 3회 반복될 수 있으며, PDGFα를 함유하는 보텐슈타인-사토(BS) 배지에서 배양된 세포로서 다량의 정제된 올을 얻는 것이 최적이다. 신경교 세포는 P2에서 위스타 래트의 대뇌 피질 로 제조되며, 이는 올리고덴드로글리알 혈통 세포의 대다수가 NG2 및 O415를발현하는 프리올리고덴드로시트인 시점이다. 참고로, OL 혈통 성숙은 마우스 및 래트에서 P2에서 유사하며, 이 프로토콜은 또한 마우스 프리-올리고벤드로시트(17)를 분리하는데 사용될 수 있다.
혼합 된 신경교 세포 배양을 흔들어 후, .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 들 중 어느 누구도 경쟁적인 이해관계나 상충하는 이해관계가 없습니다.
감사의 글
저자는 원고 편집에 대한 그의 현명한 조언에 대한 레미 론자노에게 감사드립니다. 이 작품은 ICM, INSERM, NSF에 ARSEP 재단 보조금, 부베 라브루예르 가격에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-플루오로데옥시우리딘 | Sigma | F0503 | |
| B27 보충제 | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-글루코스 용액 | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| 에탄올 100% | 시그마 | 32221-M | |
| 에탄올 70% | VWR 화학 물질 | 83801.360 | |
| 태아 송아지 혈청 | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-시스테인 | 시그마 | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| 파파인 | 워딩턴 | LS003126 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | ThermoFisher | 칼슘 | |
| 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher | A1285601 | |
| 폴리에틸렌이민(PEI) | Sigma | P3143 | |
| 테트라보레이트 데카하이드레이트 | Sigma | B9876 | |
| 트립신 | Sigma | Sigma 유리 | |
| 딘 | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (소 혈청 알부민) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher 31966021 | ||
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | ThermoFisher | 15140122 | |
| 프로게스테론 | 시그마 | P8783 | |
| 푸트레신 디하이드로클로라이드 | 시그마 | P5780 | |
| 아셀렌산나트륨 | 시그마 | S5261 | |
| T3 (3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨염) | 시그마 | T6397 | |
| T4 ( L-티록신) | 시그마 | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (소 혈청 알부민) | Sigma | A4161 | |
| 세룰로플라스민 | 시그마 | 239799 | |
| 둘베코의 변형 이글 배지 | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| 인슐린 | Sigma I5500 | ||
| N-아세틸-L-시스테인 | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 써모피셔 | 15140122 | |
| 프로게스테론 | 시그마 | P8783 | |
| 푸트레신 | 시그마 | P5780 | |
| 재조합 인간 CNTF | 시그마 | 450-13 | |
| 아셀렌산나트륨 | 시그마 | S5261 | |
| T3 (3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염) | 시그마 | T6397 | |
| 비타민 B12 | 시그마 | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µ m 필터 | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL 주사기 | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm 페트리 디쉬 | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL 튜브 | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL 튜브 | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm 페트리 디쉬 | Dutscher | 067003 | |
| 70 & 마이크로; m 필터 | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| 쌍안 현미경 | Olympus | SZX7 | |
| 곡선 집게 | 정밀 과학 도구 | 11152-10 | |
| 미세 집게 | 정밀 과학 도구 | 91150-20 | |
| 대형 수술 용 가위 | 미세 과학 도구 | 14008-14 | |
| 메스 | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| 소형 수술용 가위 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 소형 수술용 스푼 | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 플라스크 필터 캡 포함 | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar 쥐 | Janvier | RjHAn:WI |
참고문헌
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Broph....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
