세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

요약

우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.

초록

떼는 녹농균과 대장균을포함한 많은 Pseudomonas aeruginosa 세균종에서 관찰되는 표면 운동성의 한 형태이다. 여기에서, 박테리아의 조밀한 인구는 시간의 과정을 통해 특징적인 tendril 모양 지역 사회에 있는 먼 거리에 이동합니다. 떼는 중간 수분, 습도 및 영양소 함량을 포함한 여러 가지 요인에 민감합니다. 또한, 항생제 또는 박테리오파지 (파지)에 의해 스트레스를 받는 P. aeruginosa에서 관찰되는 집단 스트레스 반응은 스트레스가 함유 된 영역에 접근하는 무리를 격퇴합니다. 여기에 설명된 방법은 떼에 영향을 미치는 중요한 요소를 제어하는 방법을 설명합니다. 평판 문서 스캐너를 사용하여 높은 시간적 해상도로 군단역학 및 집단 응력 반응을 모니터링하는 간단한 방법을 소개하고 군단의 정량적 분석을 컴파일하고 수행하는 방법을 설명합니다. 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 무리의 정확하고 잘 제어 된 정량화를 제공하고 플레이트 기반 성장 측정 및 세균 종의 다른 유형으로 확장 될 수있다.

서론

떼는 숙주^{1,,2,,3에서}항생제 내성 및 독성 인자의 생산을 증가시키는 조정된 세균 운동성의 집단 형태이다. 이 다세포 행동은 폐에 있는 상피 막을 덮는 점액 층의 그것과 유사한 반 고체 표면에서 생깁니다^4,,5. 생체 계면 활성제는 일반적으로 표면의 표면 장력을 극복하기 위해 무리를 지어 생성되며 이들의 생산은 복잡한 세포 세포 신호 시스템, 일컬어 쿼럼 센싱^6,,7,,8에의해 조절된다. 많은 종의 박테리아는 녹농균, 황색포도상구균, 대장균^{9,,10,,11,,12를}포함하여 무리를 지....

프로토콜

1. P. aeruginosa 떼기 시간 경과 이미징을 위한 떼지어 한천 접시 준비

1. Na₂HPO₄•7H₂O, KH₂PO₄15 g, NaCl 2.5 g를 500 mL 이중 증류수(ddH₂O)에 추가하여 유리 병에 5x M8 최소 용지 1L을 준비합니다. 액체 매체를 살균하고 실온에서 보관하기 위해 추가 ddH₂O. Autoclave로 최종 부피를 1L로 조정합니다.
2. 100 mL의 1M MgSO₄ (황산 마그네슘)를 MgSO₄•7H₂O 50 mL ddH₂O에 24.6 g을 추가하여 유리 병에 추가하여 최종 부피를 100 mL로 조정하여 ddH₂O. 오토클레이브를 살균합니다. 실온에서 보관하십시오.
3. 50 mL ddH₂O. 추가 ddH 2 O. 멸균에 추가 ddH₂O. 오토 클레이브와 100 mL에 카사 미노 산 20g을 추가하여 유리 병에 20 % 카사 미노 산의 100 mL을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
4. 50 mL ddH_2....

결과

P. aeruginosa를성장시키는 단계는 세포를 강조하고, 떼지어 한천 판을 이미지화하는 단계는 그림 1에나타낸다. 우리는 37 °C에서 LB 국물의 2 mL에서 LB-한천 플레이트에서 야생 형 P. aeruginosa UCBPP-PA14 균주의 단일 콜로니를 접종하고 떼지어 한천 판의 중앙에서 5 μL을 발견했습니다. 이 판의 시간 경과 화상 진찰은 중앙에 있는 식민지의 양식에 있는 초기 성장을 제시하고 그 때 식민지에서 근사상으로 tendrils의 퍼지는(비디오 1). 집단 스트레스 반응 분석의 경우, 중앙에서 P. aeruginosa를 발견하는 것 외에도, 동일한 야간 배양의 30 μL은 1 x 10¹² pfu/mL DMS3vir의 6 μL 또는 3 mg/mL 의 6 μL의 5:1 및 6 μL의 비율로 위성 위치에서 발견된다. 떼는 떼가 많은 한천판의 중심에서 주변으로 이동하며 파지에 감염된 박.......

토론

이 프로토콜은 한천 판의 가변성을 최소화하고 P. aeruginosa 떼지어 스트레스에 대응하는 시간 경과 이미지를 획득하는 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 이 절차는 매체 조성 및 성장 조건을 적응시킴으로써 다른 세균 시스템을 이미지화할 수 있다. P. aeruginosa의경우, M9 또는 FAB 최소 배지가 떼지어^16,21을유도하는데 사용될 수^있지만,여기에 제시된 프로토콜은 카자미노산, 포도당 및 황산 마그네슘^6과M8 배지를 사용한다. P. aeruginosa 떼는 아미노산^{22,,23,,24를}포함하는 철 가용성 및 영양 공급원과 같은 중간 조성물에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010	LB-한천 플레이트 및 군집 한천 플레이트용
Casamino acids	BD Difco	223050	군집 매체용
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	덱스트로스. 군집 매체
용 Fosfomycin disodium salt	Tokyo Chemical Industry	F0889	재고 농도 : 200 mg / mL. ddH2O
겐타마이신 설페이	시그마-알드리치	G1914	원료 농도: 3mg/mL. ddH2O
카나마이신 설페이	시그마-알드리치	60615	재고 농도: 100mg/mL. ddH2O
LB-Miller	BD Difco	244620	LB 국물 및 LB-한천 플레이트용
황산마그네슘 헵타하이드레이트	Sigma-Aldrich	230391	스워밍 매체용
인산칼륨 일염기성	Sigma-Aldrich	P0662	5x M8 매체용
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S9888	5x M8 매체용
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트	Fisher Chemical	S373	5x M8 매체용
<강력한>균주
녹농균	Siryaporn lab	AFS27E.118	PA14 균주
DMS3vir	O'Toole lab	DMS3vir20	Bacteriophage
< strong>Supplies
Aluminium oxide 사포	3M	150 Fine	검은 뚜껑 검은
색 직물	Joann	PRD7089	검은 색 직물
검은 스프레이 페인트	Krylon	5592 매트 블랙	검은 뚜껑
삼각 플라스크	Kimax	26500	250 mL
유리 저장 병	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1,000 mL
8 인치 지퍼 타이	가드너 벤더	E173770	검은 색 무광택 패브릭
페트리 접시 (100mm x 15mm)	Fisher		FB0875712 100mm x 15mm 폴리스티렌 플레이트
나무 막대	Fisher	23-400-102	박테리아 줄무늬 및 접종 용
<강력한>장비< / 강력>
오토클레이브	시장 Forge Industries	STM-E	살균 시약용
25 mL 피펫	USA Scientific, Inc.	1072-5410	한천 플레이트 떼를 위한 20mL 피펫
제습기	Frigidaire	FAD704DWD 70파인트	약 45%에서 실내 상대 습도를 유지하기 위해
ImageJ	NIH	v1.52a	이미지 분석용 소프트웨어
인큐베이터	VWR	89032-092	37°C에서 박테리아 성장; C
Isotemp 수조	Fisher	15-462-21Q	55°C까지 냉각 매체용; C
층류 후드	The Baker Company	SG603A	건조 플레이트
용 P-20 피펫	Gilson	F123601	떼 짓는 한천 플레이트에 스포팅
피펫 컨트롤러	BrandTech	accu-jet	천 플레이트 떼 짓기 용 20 mL
롤러 드럼	뉴 브런 즈윅	TC-7	100 rpm에서 박테리아 성장 용
스캐너	Epson	Epson Perfection V370 이미징	플레이트용 포토 스캐너
스캐너 자동화 소프트웨어	RoboTask Lite	v7.0.1.932	30분 내부 이미징
스캐너 이미지 수집 소프트웨어	Epson	v9.9.2.5US	이미징 플레이트용 소프트웨어

트 에 용해 트 에 용해 부착 용기 한