방법 논문

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

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DOI:

10.3791/60917

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2020년 3월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

이 논문에서

요약

초파리는 암 치료를 위한 잠재적인 적용을 가진 약물을 선별하기 위하여 적당히 널리 이용되는 실험적인 모형입니다. 여기에서, 우리는 헤테로크로마틴 형성을 촉진하는 소분자 화합물을 스크리닝하는 방법으로 서 드로소필라 의 사용 바리게이트 눈 색 표현형을 기술한다.

초록

초파리는 암 치료에 유용할 지도 모르는 화합물을 가리기 위하여 이용될 수 있는 우수한 모형 유기체입니다. 여기서 설명한 방법은 초파리를이용하여 헤테로크로마틴 촉진 화합물을 식별하는 비용 효율적인 생체내 방법이다. Drosophila의 DX1 긴장은, 헤테로크로마틴 형성의 넓이를 반영하는 다양한 눈 색깔 표현형을 갖는, 이함으로써 헤테로크로마틴 촉진 약물 스크린을 위한 공구를 제공한다. 이 스크리닝 방법에서, 눈의 변이는 눈의 일부를 차지하는 적색 색소침착의 표면적에 기초하여 정량화되고 1에서 5까지의 척도로 채점된다. 스크리닝 방법은 간단하고 민감하며 생체 내에서 화합물을 테스트 할 수 있습니다. 이 방법을 이용한 약물 스크리닝은 암 치료제에 유익한 효과를 가질 수 있는 헤테로크로마틴 촉진 약물을 식별하는 빠르고 저렴한 방법을 제공한다. 헤테로 크로 마틴의 형성을 촉진 하는 화합물을 식별 또한 암 개발의 후성 유전학 메커니즘의 발견으로 이어질 수 있습니다.

서론

헤테로크로마틴은 유전자 발현, 세포 분열 시 염색체 분리 조절, 게놈불안정성으로부터 보호하는 데 핵심적인 역할을 하는 응축된 형태의 DNA입니다. 헤테로크로마틴은 유전자 억압 조절기로 간주되어 세포 유사분열 시 염색체 무결성을 보호하는22,3. 그것은 계보 약속 동안 히스톤 H3 리신 9 (H3K9me)의 디- 및 삼중 메틸화와 연관4,,5. 더욱이, 헤테로크로마틴 단백질 1(HP1) 크로모도메인 단백질의 모집은 또한 헤테로크로마틴 및 유전자 발현의 후생유전학적 억압과 관련이 있는 것으로 여겨진다6. 이 단백질은 헤테로크로마틴 형성의 필수 구성 요소및 마커입니다.

게놈 불안정성은 세포가 발암을 촉진하는 유전적 변화를 획득할 수 있게 하기 때문에, 헤테로크로마틴은 암 발병에서 더욱 인정받고 있으며 암 치료 대상으로 삼을 수 있다7,,8. 현재, 헤테로 크로 마틴 형성을 돕는 데 잘 확립 된 약물은 없습니다. 여기에서, 우리는 헤테로크로마틴 형성을 승진시키는 작은 분자 화합물을 검열을 위한 간단하고 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 검열은 소분자 약의 도서관으로 Drosophila를 취급해서 행해않습니다. 이 방법은 헤테로크로마틴 수준에 의해 영향을 받는 DX1초도체 균주에서 다양한 눈 색깔 표현형을 이용합니다. DX1 파리는 7개의 P[lac-w] 트랜스유전자의 탠덤 배열을 포함하며, 이는 헤테로크로마틴화에 따라 다양한 발현/우울증을 가지며, 따라서 눈 색깔의 변이 정도는 헤테로크로마틴 수준을 반영한다. 특히, 이종으로마틴을 증가시키면 다양한 눈 색깔(흰 눈)의 비율이 증가하여 검출될 수 있다. 반대로, 감소하는 헤테로크로마틴은 P[lac-w] 이식유전자 발현(적목)의 상승 비율에 의해 검출될 것이다9,,10,,11,,12.

따라서, 우리는 그것의 표현이 존재하는 헤테로크로마틴의 양과 직접 상관되기 때문에 다양한 눈 색깔 표현형을 생성하는 이 Drosophila transgene 시스템을 이용합니다. 헤테로 크로 마틴 형성을 촉진 하는 것으로 의심 되는 화합물의 발견 시, 우리는 서쪽 얼룩 등 다른 방법을 사용 하 여이 의심을 확인할 수 있습니다. 이러한 헤테로크로마틴 촉진 물질은 향후 환자에서 임상 시험을 위해 추가로 개발될 수 있다.

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프로토콜

1. 약품 도서관 준비

  1. 원하는 농도에서 적절한 용매를 사용하여 스크리밍될 약물 라이브러리를 식별하고 준비합니다(예를 들어, DMSO에서 10 mM).
    참고: 약물 라이브러리에 대한 구체적인 예는 국립 암 연구소 (NCI) 발달 치료 프로그램 (DTP)에서 종양학 세트 III입니다. 이 세트의 화합물은 2개의 96웰 PP U-바닥 플레이트에서 100% DMSO에서 10 mM에서 20 μL로 제공되고 -20°C에서 보관된다. NCI 플레이트지도, 각 약물의 기본 화학 데이터는 다음 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다:
    NCI 플레이트 번호 4740
    NCI 플레이트 번호 4741

2. 초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물 에 대한 화면

  1. 초파리 사육 전략(그림 1A)
    1. 일 1: 십자가 3 w1118/Y; DX1/CyO 수컷은 3개 이상의 처녀 w1118 암컷이 표준 드로소필라 식품 매체(블루밍턴 레시피)의 9mL를 가진 25mm x 95mm 식품 바이알로 날아간다. 각 약물에 대해 3개의 복제 바이알과 화면에 대한 하나의 컨트롤을 설정합니다.
      참고 : DX1 파리는 친절 제임스 버클러 (미주리 대학)9,,13에의해 제공되었다 .
    2. 2일차와 3일차: 파리가 실온(22°C)에서 2일 동안 알을 낳도록 합니다.
    3. 4일차:CO2 가스를 짧게 터뜨려 부모 파리를 마취시키고 부모 파리를 "플라이 모그"(알코올 70%가 들어있는 병)로 폐기하십시오.
  2. 스크리닝을 위해 초파리에 약물을 공급하십시오.
    1. 원래 재고 (96 웰 PP U-bottom 플레이트에서 100 % DMSO에서 100 % DMSO에서 10 mM에서 20 μL)에서 물에서 33 % DMSO로 10 μM 최종 농도로 각 약물 화합물을 희석합니다. 대조군으로 어떤 약물도 없이 물에 33% DMSO를 사용하십시오.
      참고 : 일부 약물은 물에 잘 용해되어 DMSO에 용해되었습니다. 100% DMSO는 파리에 독성이 있습니다. 33%는 견딜 수 있습니다.
    2. 4일: 10 μM 약물 용액의 파이펫 60 μL 또는 플라이 푸드 의 상부에 대한 제어. 이 시점에서, 부모 파리가 제거되었는지 확인하고 음식에 첫 번째 별 애벌레를 기어 다니는 계란이 있는지 확인하십시오.
    3. 일 6: 식품 바이알에 동일한 10 μM 약물 용액의 60 μL을 반복피펫팅.
      참고 : 약물이 플라이 푸드에 첨가되었기 때문에 상부 표면 식품에는 거의 10 μM 농도가 포함되어 있으며 바닥 식품은 완전히 침투 할 수 없습니다. 모든 파리는 음식 위에 알을 낳고 상단 표면 음식을 먹는다.
  3. 눈 색깔 변화를 관찰하고 점수를 매줄 수 있습니다.
    1. F1 파리가 나타난 후 이틀(약 14일째)에 파리를 검사합니다. 짧은 CO2 를 사용하여 F1 파리를 마취하고 유리병에서 필터 용지 아래에서 CO2를 홀짝인 다공성 해부 패드로 제거합니다.
    2. 해부 현미경으로이 패드에 파리를 검사합니다. 전체 비행을 검사하고 모든 w1118/ Y를 식별; 그들의 부족으로 DX1/+ 헤테로지쿠스 남성은 CyO 지배적인 곱슬 날개 표현형이 결여되었다.
    3. w1118/Y각각의 눈 색깔을 점수; DX1/+ 헤테로지쿠스 수컷은 1에서 5까지의 척도로 날아갑니다(그림1B). 흰색 눈 색의 백분율은 다음과 같이 평가되었습니다.
      1. 적색 산란 눈 총 표면적 5%
      2. 6% - 25% 적색 반점 눈 의 총 표면적
      3. 26% - 50% 적색 반점 눈 의 총 표면적
      4. 51% - 75% 적색 반점 눈 의 총 표면적
      5. >75% 적색 반점 눈 의 총 표면적
      참고: 또는 100% 메탄올로 플라이 헤드를 균질화하고 분광계를 사용하여 OD 450 nm에서 눈 색소 침착을 측정합니다. PEV가 DX1 남성에서 더 발음되므로 남성만 선택하십시오. 각 유리병에 10 개 이상의 남성을 점수.
    4. 득점한 각 바이알의 모든 남성의 평균 색인을 계산합니다. 각 화합물에 대해 삼중체를 수행합니다(그림1C).
      참고: 아이 컬러는 연령에 따라 다르기 때문에 시간이 많이 민감한 단계입니다. 눈 색깔은 2 일 된 같은 나이에 계산해야합니다. 보통 >10 파리는 각 유리병에 점수를 매겨야 합니다.
    5. 화합물이 실제로 헤테로크로마틴 형성을 촉진한다는 것을 확인하려면, 유효성을 검사하기 위해 서양 블로팅과 같은 다른 기술을 사용한다(도1G).

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결과

이 프로토콜은 성공적으로 약물 개발을위한 생체 내에서 효율적이고 저렴한 비용인 Drosophila에서헤테로 크로 마틴 형성을 촉진하는 화합물을 스크리킹하는 데 사용되었습니다(그림 1). 우리는 소분자 약물 라이브러리, 종양학 세트 III를 선별, 이는 97 FDA 공인 종양학 약물로 구성, Drosophila 멜라노가스터의 DX1 균주를 사용하여(그림 1B). 유의한 약물에 대한 결과는 막대그래프(도 1C,D)로나타내어 졌다. 선별 분석법에 따르면, 메토트렉세이트(4-aminopteroylglutamic acid)는 라이브러리에서 E7로 코딩되어 DX1 균주에서 가장 많은 변동을 일으켰으며, 이는 메토트렉세이트가 향후 암 표적 요법을 위한 가장 유...

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토론

헤테로크로마틴은 유전자 발현 조절에 중심적인 역할을 하는 응축된 형태의 DNA입니다. 암에서 점점 더 인식되고 있으며 암 치료15,,16,,17,,18에대한 잠재적인 표적으로 작용할 수 있다. 소분자 화합물은 인체의 제조, 보존 및 신진 대사의 장점으로 인해 약물 개발에 일반적으로 사용됩니다. 헤테로크로마틴 촉진 소분자 화합물을 확인하기 위해, 효율적인 방법은 DX1Drosophila 균주를 사용하여 설계 및 제시되었으며, 이는 헤테로크로마틴 의존적 방식으로 파리의 눈 색깔에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다(그림 1).

당사의 스크리닝 프로토콜은 약물 개발을 위한 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

우리는 J. 버클러, E. 바흐와 다양한 초파리 균주에 대한 블루밍턴 드로 소필라 스톡 센터 감사합니다; 종양학을 위한 국립 암 학회 (NCI) 발달 치료 프로그램 세트 소분자 약 도서관; 에이미 장, 유, 제시카 싱방가, 레이첼 메자, 알렉스 차베스 등 UCSD 학부생들. 이 간행물에 보고된 연구는 J.L.에 미국 흉부 학회에서 연구 교부금및 NIH에서 자금 조달에 의해 지원되었습니다: R01GM131044 W.X.L.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DrosophilaDX1 strainDX1 파리는 James Birchler(University of Missouri)
Drosophila 식품 매체UCSD 플라이 키친
메토트렉세이트NCI 약물 라이브러리
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마D2650
에틸 알코올시그마E7023-500ML

참고문헌

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