혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.
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이 논문에서
요약
초록
혈액 뇌 장벽 (BBB) 신경 혈관 단위에 의해 형성 된다 (NV) 그 중추 신 경계를 보호 (CNS) 미묘한 뇌 기능을 방해할 수 있는 혈액에서 발견 하는 요인의 범위에서. 이와 같이, BBB는 CNS에 치료제의 전달에 주요 장애물이다. 축적 된 증거는 BBB가 신경 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. 따라서, CNS 표적 약물의 침투를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 해명할 수 있는 BBB 모형을 위한 엄청난 필요가 있습니다.
우리는 최근에 인간에게 완전히 개인화된 BBB 칩을 생성하기 위하여 기관 온 칩 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 기술을 결합했습니다. 이 새로운 플랫폼은 인간 BBB를 통해 약물 및 분자 수송의 예측에 적합한 세포, 분자 및 생리학적 특성을 표시합니다. 또한 환자 별 BBB 칩을 사용하여 신경 질환 모델을 생성하고 개인화 된 예측 의학 응용 프로그램의 잠재력을 입증했습니다. 여기에 제공된 iPSC 유래 BBB 칩을 생성하는 방법을 보여주는 상세한 프로토콜이 제공되며, iPSC 유래 뇌 미세 혈관 내피 세포(iBMECs)의 분화로 시작하여 신경 전구를 함유하는 혼합 신경 배양물의 결과로 시작되며, 차별화 된 뉴런, 및 성상 세포. 또한 조절된 층류 하에서 장기 칩 내로 세포를 시드하고 BBB 칩을 배양하는 절차도 기술되어 있다. 마지막으로, BBB 칩 분석에 대한 상세한 설명은 칩 내의 세포 유형의 조성을 결정하기 위한 면역세포화학적 방법뿐만 아니라 약물 및 분자 투과성을 평가하기 위한 파라셀룰러 투과성 분석법을 포함한다.
서론
BBB는 순환 혈액에서 CNS를 분리하는 높게 선택적인 방벽입니다. 그것은 잠재적으로 파괴적인 물질에서 중요 한 뇌 기능을 보호, 요인, 그리고 또한 영양소와 뇌 항상성을 유지 하는 데 필요한 다른 대사 산물의 유입을 허용 하는 동안1. BBB는 다세포 NVU로서 골상세포, 성상세포 종보 및 신경 과정이 뇌 미세 혈관 내피 세포(BMECs)와 직접 접촉합니다. 이러한 상호 작용을 통해 BMECs는접합부2,3에의해 지지되는 특수 장벽 특성을 형성할 수 있습니다. 이 방벽의 대형은 분자의 paracellular 통행을 제한합니다, 그러나 능동적으로 CNS로 분자를 수송하기 위하여 편광한 수송자를 포함합니다 또는 혈액으로 다시1. 이러한 독특한 장벽 특성으로 인해 BBB는 바이오 의약품을 뇌로 전달하는 데 큰 장애가 되며 FDA 승인 소분자의 5% 미만이 CNS4에도달할 수 있는 것으로 추정됩니다.
동물 모델은 BBB 개발5에관여하는 BBB 침투 및 분자 메커니즘을 연구하는 ....
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프로토콜
1. iPSC 유래 신경 전구 세포 (iNPC)의 생성
- 아래에 설명된 바와 같이 iPSC 콜로니에서 EZ 구를 생성하고 이전에 출판된20,21,22.
- 배양 iPSC 콜로니는 mTESR1 또는 기타 상용 매체에서 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트(0.5 mg/플레이트)에 대한 합류를 한다(재료 표참조).
- iPSC 배지를 제거하고 EZ 구 배지의 2 mL로 교체 [ESM; DMEM:F12 7:3 100 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 100 ng/mL 표피 성장 인자, 5 μg/mL 헤파린, 2% B27 보충제]로 보충되었습니다.
- 멸균 1000 μL 파이펫 팁 또는 셀 스크레이퍼의 뒷면으로 각 수량의 바닥을 잘 긁어냅니다.
- 모든 세포를 수집하고 자유 부동 구체의 자발적형성을 허용하기 위해 초저 부착 T25 플라스크에 배치합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 매개체가 노란색으로 변할 때 매 번 2-3일마다 매 개체의 절반을 신선한 ESM으로 대체하여 구체에 먹이를 주어 ....
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결과
그림 6A, B,C는 "혈액 측"하단 채널에 "뇌 측"상단 채널및 iBMECs에 EZ 구체시드 BBB 칩을 나타냅니다. iBMECs는 먼저 시드하고 EZ 구체를 시드 한 후 하룻밤 부착 할 수 있었습니다. 칩은 7 일 동안 매일 미디어 교체와 정적 조건에서 배양되었다. BBB 칩은 RT에서 4% PFA를 사용하여 10분 동안 고정하고 DPBS로 3x 세척하였다. 면역세포화학은 1) 신경 전구 세포에 대한 마커로서 1) 네스테인을 사용하여 BBB 칩상에서 수행되었고, 2) S100β 또는 GFAP를 성상세포에 대한 마커로서, 3) βIII-tubulin을 뉴런에 대한 마커로서 수행하였다. GLUT-1 및 페캄-1은 BMECs에 대한 마커로서 사용하였다. 이미징은 공초점 현미경을 사용하여 20x에서 수행되었고 이미지는 ImageJ 소프트웨어용 피지를 사용하여 처리되었습니다.
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토론
NVU의 장기 온 칩 기술과 iPSC 유래 세포의 조합은 인간 BBB의 정확한 모델링에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 여기서는 최근에 게시된 iPSC 기반 BBB 칩16의간단하고 강력한 응용을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 시드 패러다임의 개요와 타이밍은 그림 3에나와 있습니다. BBB 모델링에 적합한 장벽 함수를 획득하고 유지관리하려면 균일한 iBMEC 단층을 생성하고 무결성을 유지하는 것이 중요합니다. 기능성 단층의 생성을 향한 첫 번째 단계는 ECM 단백질의 부착을 허용하는 비극성 PDMS 표면의 화학적 활성화를 포함한다. 표면 활성화 시약은 재구성 시 급격히 저하되어 결국 세포의 최적이 아닌 부착을 초래할 수 있습니다. 따라서 시약을 신선하고 공정 전반에 걸쳐 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.
UV 활성화(섹션 5.2) 동안, 시약은 일관된 ECM 코팅과 균질한 세포.......
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공개 사항
시더스-시나이는 연구의 미세 유체 기관 칩을 생산하는 회사인 에뮬레이트(Emulate)에 소수 주식 지분을 소유하고 있습니다. 시더스-시나이의 임원은 에뮬레이트 이사회에서 근무하고 있습니다. 에뮬레이트는 이 연구에 대한 재정적 지원을 제공하지 않았습니다. 시더스-시나이와 에뮬레이트는 이 작품과 관련된 특허를 출원했습니다.
감사의 글
중요한 편집에 대해 소샤나 스벤센 박사님께 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 보조금 에 의해 지원되었다 1621/18, 과학 기술부 (MOST), 이스라엘 3-15647, 재생 의학 교부금 ID ID1-08800, 셔먼 가족 재단, NIH-NINDS 교부금 1UG3NS105703, 및 ALS 협회 보조금 18-SI-389. AH는 발렌베르크 재단(교부금 번호 2015.0178)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | 해리 용액 |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial 섬유산성 단백질(GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | 글루타민 보충제 |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | 기저막 매트릭스 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | 생물학 산업 | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | 생물학 산업 | 05-100-1A | 대체 매체 |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| 혈소판 부족 혈장 유래 소 혈청(PPP) | 생물 의학 기술 | J64483AB | |
| 레티노산(RA) | 시그마 | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 유닛 | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 단클론 항체 | Invitrogen | 33-9100 | |
| β III-튜불린(Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-메르캅토에탄올 | Life Technologies | 31350010 |
참고문헌
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V.
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재인쇄 및 허가
