쥐의 모터 피질에서 레이저 유도 된 뇌 손상

전 세계적으로 뇌졸중은 두 번째 주요 사망 원인이며 장애^1의세 번째 주요 원인입니다. 뇌졸중은 또한 심각한 장애로 이어지며 종종 의료진과 친척으로부터 추가 치료를 필요로합니다. 그러므로 장애와 관련된 합병증을 이해하고 더 긍정적인 결과를 위한 잠재력을 향상시킬 필요가 있습니다.

동물 모델의 사용은 질병을 이해하는 초기 단계입니다. 최상의 연구 결과를 보장하기 위해 일반적인 모델에는 간단한 기술, 경제성, 높은 재현성 및 최소한의 가변성이 포함됩니다. 허혈성 뇌졸중 모델의 결정요인은 뇌 부종 부종 부피, 경색 크기, 혈액 뇌 장벽 (BBB) 고장의 정도 및 일반적으로 신경 학적 심각도 점수^2를통해 평가되는 기능 장애를 포함한다.

설치류 모델에서 가장 널리 사용되는 뇌졸중 유도 기술은 중간 뇌동맥(MCA)을 일시적으로 또는 영구적으로^3으로바폐합니다. 이 기술은 인간에 있는 것과 유사한 치기 모형을 생성합니다: 그것은 치기 지역을 둘러싼 음경을 가지고 있고, 높게 재현할 수 있고, 허혈 기간 및 재관류^4를조절합니다. 그럼에도 불구 하 고, MCAO 방법은 몇 가지 합병증이 있다. 이 기술은 종종 추가 결과^5,6,67로이끌어 내는 시각 피질 및 일반적인 고온증의 기능 장애를 가진 입각 망막에 두개 내 출혈 및 상해를 경향이^{있습니다.} 그밖 한계는 유도한 치기에 있는 높은 변이를 포함합니다 (외부 경동맥 지구같이 의도하지 않은 지구에 허혈의 가능성 연장에서 생기는), MCA의 불충분한 폐색, 및 조기 재관류. 또한, 다른 균주와 크기의 쥐는 다양한 경색 볼륨^8을나타낸다. 언급 된 모든 단점 외에도 MCAO 모델은 카테터화에 대한 최소 혈관 크기의 요구 사항 측면에서 기술적으로 제한적이기 때문에 깊은 뇌 영역에서 작은 고립 된 뇌졸중을 유도 할 수 없습니다. 따라서 대체 모델에 대한 필요성이 더욱 중요해집니다. 또 다른 방법, photothrombosis, MCAO 절차에 대한 가능한 대안을 제공하지만 효율^9에개선되지 않습니다. 이 기술은 빛으로 스트로크를 대상으로하고 이전 모델에 몇 가지 개선을 제공합니다. 그러나, 광혈전증은 이차^상화9과연관되는 침략적인 두개부 절제술을 요구합니다.

설명된 단점에 비추어 볼 때, 여기에 제시된 프로토콜은 설치류의 뇌 손상을 유도하기 위한 유능한 대체 레이저 기술을 제공합니다. 레이저 기술의 작용 메커니즘은 살아있는 조직에 부여 된 레이저의 광열 효과를 기반으로하며, 이는 신체 조직에 의한 광선의 흡수와 열로의 변환으로 이어집니다. 레이저 기술을 사용하는 장점은 조작의 안전성과 용이성입니다. 레이저의 출혈을 중지 하는 열을 생산 하는 능력은 의학에서 매우 중요 한, 주어진 된 만남 지점에서 다른 빔을 증폭 하는 그것의 능력은 레이저 대상 점의 방해에 서 건강 한 조직을 파괴 방지 보장 하는 동안^10. 이 프로토콜에 사용되는 레이저 빔은 에너지를 방출하거나 파괴를 일으키지 않고 뼈와 같은 낮은 액체 매체를 통과할 수 있습니다. 일단 두뇌 조직과 같은 높은 액체 매체에 도달하면, 표적 조직을 파괴하는 그것의 에너지를 이용합니다. 기술, 따라서, 뇌의 적절 한 영역에서만 뇌 손상을 유도할 수 있습니다.

여기에 제시 된 기술은 조사 수준을 조절하는 능력의 엄청난 금액을 보여 주었다, 처음부터 의도 된 뇌 손상의 선택 된 변화를 생산. 피질과 줄무늬 모두에 영향을 미치는 원래 MCAO와는 달리, 레이저 기술은 의도 된 모터 피질에만 부상을 유도, 뇌 손상의 영향을 조절 할 수 있었다. 본 명세서에서, 레이저 유도뇌 손상 프로토콜 및 쥐의 대뇌 피질상에서 수행되는 절차에 대한 대표적인 결과의 요약이 제공된다.

다음 절차는 유럽 공동체의 실험 동물 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 또한 네게브의 벤 구리온 대학에 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 동물 선택 및 준비

1. 이 절차에 대한 과도한 병리학없이 300에서 350 g의 무게 65 남성 Sprague-Dawley 쥐를 선택합니다. 크기가 작을수록 MCAO 절차에 기술적 어려움이 있습니다.
2. 케이지 당 3 마리의 쥐를 할당하고 3 일 동안 적응하게하십시오.

2. MCAO 절차

1. MCAO에 대한 25 마리의 쥐를 선택하여 10-20% 사망률과 관련된^{사망률(11)을}허용한다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 표준 기술을 사용하여 MCAO를^{수행한다(12)}.

3. 레이저 로 인한 뇌 손상 실험 절차

1. 레이저 그룹으로 표시된 그룹에 20마리의 쥐를 할당하고 20마리의 쥐를 다른 대조군에 할당한다(샴 조작).
2. 다음과 같은 방식으로 50J X 10 포인트에서 레이저 조사레이저 그룹 쥐를 피사체:
   1. 쥐를 산소에 2% 이소플루란을 혼합하여 쥐를 마취하여 자발적인 환기를 허용합니다. 철회 반사의 부재를 확인하기 위해 집게로 꼬리를 꼬집어 충분한 마취 깊이를 확인합니다.
   2. 직장 온도 조절 가열 패드를 사용하여 실험 절차 전반에 걸쳐 37 °C에서 쥐의 핵심 체온을 유지합니다.
   3. 면도기로 현지 모발을 제거하고 70% 알코올과 0.5% 클로르헤시딘 글루코네이트로 소독합니다. 소독 단계를 두 번 더 반복합니다.
      참고: 수술 절개 크기는 약 3cm여야 합니다. 절개 부위 주위에서 적어도 2cm의 모발을 제거합니다.
   4. 쥐를 입체 헤드 홀더에 놓고 3cm 절개를 하여 두피를 측면으로 반사하고 브레그와 람다 사이의 영역을 노출시합니다.
   5. 코 콘을 통해 마취를 유지합니다.
   6. 네오디뮴-YAG(Nd-YAG) 레이저(피크 파장 1064 nm)를 사용하여 50J X 10점,펄스 지속시간 1개를 오른쪽 반구 위의 두개골 노출 부위에 투여합니다.
   7. 장치의 레이저 생성 부분이 레이저 빔을 생성하기 위해 노출 된 영역에서 2mm 거리에 있는지 확인합니다. 50J X 10 포인트는 다른 에너지 / 표면 조합의 신중한 평가 후 선택되었다. 이 조합은 효율적이며 두 번째¹⁰미만의 투여 후 두개골의 뼈 파괴를 일으키지 않습니다.
      참고: 2mm는 레이저 빔의 단말(통과되는 광 케이블에서)과 두개골 뼈 사이의 거리입니다. 초점 렌즈를 사용하는 경우, 원하는 손상 영역에서 빔을 집중하기 위해 렌즈의 경사 각도를 고려하여 거리를 계산해야 합니다. 적절한 훈련 및 눈 보호 기능을 포함한 레이저 장치를 사용할 때 적절한 안전성을 보장합니다.
   8. 장치에서 쥐를 제거하고 3-0 실크 수술 봉합사로 두피를 닫습니다.
   9. 마취를 중단하고 회복을 위해 쥐를 케이지로 돌려놓습니다. 수술 직후 수술 후 통증을 줄이기 위해 0.25%의 부피바카인을 국소투여한다.
      참고: 올바르게 수행된 경우 전체 프로시저가 5분 미만으로 지속됩니다.
3. 마취 후 회복 중 고통의 징후는 쥐를 관찰하십시오. 마취에서 출현하기 전에 수술 후 진통을 위해 0.01mg /kg 근육 내 buprenorphine을 주고 적어도 48 h에 대해 12 시간마다 반복된 복용량을 계속하십시오.
4. 레이저에 복종하지 않고 동일한 조건으로 대상 제어 쥐.

4. 신경학적 심각도 점수 (NSS)

1. 43점^{점수(13)를}사용하여 레이저 유발 뇌 손상 후 신경학적 심각도 점수 24h를 평가한다. 신경 학적 결핍, 행동 장애, 빔 균형 작업 및 반사 신경에 대한 동물을 테스트하여 이전에 자세히 설명한^13과같이 더 심한 장애에 대해 더 높은 점수를 할당합니다.

5. 부상 후 조작

1. NSS 평가 후, 20% 산소와 80% CO2(영감을 통해)에 노출시켜 쥐를 안락사시키고, 분리된 인산염 완충식식염(PBS, 0.9% NaCl)으로 쥐를 분리한다.
   참고: CO_2가 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 미리 정해진 속도로 전달되도록 하십시오. 이 단계는 또한 5% 이소플루란 마취하에서 수행될 수 있다.
2. 두뇌를 수확하고 이전 프로토콜^(11)에설명 된 바와 같이 추가 검사를 준비한다.
3. 두개골에서 격리 된 후 전체 뇌의 육안 검사를 통해 지주 막 출혈 (SAH)에 대해 평가하십시오. 필요한 경우 현미경 또는 돋보기 안경이 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다.

6. 뇌 손상 평가

1. TTC 염색에 의해 뇌 의 광피 볼륨과 뇌 부종 결정
   참고: 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화물(TTC) 염색은 뇌경색^{검출(11)에}편리한 절차이다.
   1. 수확한 뇌를 각 2mm 두께의 6개의 코로나 슬라이스로 섹션화합니다.
   2. 0.05% TTC에서 37°C에서 30분 동안 각 뇌의 슬라이스 세트를 배양합니다.
   3. 염색 후 1600 X 1600 dpi의 해상도로 광학 스캐너로 슬라이스를 스캔합니다.
   4. 고정 된 뇌 슬라이스의 얼룩이없는 영역은 경색^12로정의됩니다.
   5. 이미지 처리 소프트웨어(예: 프리웨어 이미지 J)를사용하여 6개의 코로나 슬라이스 각각에 대해 스테인드 아웃영역, 입시 및 반구를 측정합니다.
   6. 전체 뇌의 백분율로 경각체 볼륨을 계산합니다.
      
   7. 카플란 방법을 사용하여 뇌 부종을 계산합니다.
      
2. 혈액 뇌 장벽 (BBB) 파손의 정도를 결정
   참고: 다음과 같이 레이저로 인한 뇌 손상 후 BBB 파손 24시간 평가:
   1. 관리 2% 에반스 블루와 혼합 4 mL/kg 식염수 용액 에 정맥 내 수 분 꼬리 정맥을 통해 쥐와 1 시간 동안 순환 하는 용액을 허용.
   2. 쥐를 20% 산소와 80% CO_2(영감을 통해) 24h에 노출시킴으로써 쥐를 안락사시키는데, 이는 지난 NSS^{이후, 13.}
   3. 다음과 같이 내트라바스내로 국부화된 염료를 수확하십시오.
      1. 외과 용 핀셋과 수술 가위를 가진 쥐의 가슴을 엽니 다.
      2. 오른쪽 아트리움에서 무색 관류 액체를 얻을 때까지 110mmHg를 사용하여 왼쪽 심실을 통해 0.9 % 식힌 식힌 동물들을 퍼퓨즈하십시오.
   4. 두뇌를 수확하고 2mm 조각으로 로스트로코콜리를 슬라이스.
   5. 왼쪽 뇌 조각을 오른쪽 부분에서 분리하여 부상과 비부상 반구를 별도로 평가합니다.
   6. 계량, 모르타르와 페슬을 사용하여 균질화 한 다음 뇌 조직을 24 시간 동안 50 % 트리 클로로아세트산으로 배양합니다.
   7. 원심분리기균화된 뇌 슬라이스를 10,000 × g에서 20분 동안 슬라이스합니다.
   8. 원심분리된 뇌로부터 1mL를 1.5mL의 96% 에탄올과 혼합하고 620nm 내분 파장(10nm 대역폭)과 680nm 방출 파장(10nm 대역폭)에서 형광 검출기를 사용하여 혈액-뇌 장벽 파손을 평가한다.
      참고: 쥐의 두 그룹은 BBB 고장을 결정하기 위한 동일한 프로토콜을 거칩니다.

사망 또는 SAH는 대조군 또는 실험집단(표1)에등록되지 않았다. MCAO 그룹은 사망률과 SAH 모두의 20%의 비율을 가졌습니다.

두 그룹의 쥐의 상대적인 체온 변화도 두 그룹의 가변성의 차이에도 불구하고 유사하였다(표1).

레이저(16±1.1)와 MCAO(20±1.5) 모델 모두에서 훨씬 더 악화된 NSS가 있었고, 샴 조작 대조군(1±0.3)에 비해; 표 1; p&0.01).

레이저 유도 된 뇌 손상은 또한 표적 반구에서 경피부 부피가 현저한 증가를 일으켰으며, 샴 조작 대조군 (2.4 % ± 0.3 대 0.5 % ± 0.1; 표 2 및 그림 1A; p&0.01), Mann-Whitney U 테스트당. 그러나, 레이저 모델의 경피량은 MCAO 기술(2.4% ± 0.3 vs 9.9% ±2.9)에 비해 작아졌다.

뇌 부종은 뇌 손상 후 24 h를 확인 도 1B 및 표 2에표시됩니다. 레이저 유발 뇌 손상 모델과 샴 조작 대조군(3.4% ± 0.6 vs 0.7% ±1.2)사이에뇌 부종에는 차이가 없었다. 레이저 모델과 MCAO 기술(3.4±0.6 vs 7 ±2.6†) 사이에 뇌 부종에 상당한 차이가 있었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됩니다.

샴 조작 대조군에 비해, 레이저 유도 뇌 손상 및 MCAO 기술은 모두 비부상 반구(563 ng/g ±66 및 1176 ng/g ±168) 에서 BBB 파손의 현저한 증가를 일으켰으며, 각각 141 ng/g±14; 그림 2A 및 표 2; p&0.01) 및 표적 반구(2204 ng/g ±280 및 2764 ng/g ±256, 각각, 대 134 ng/g ±11; 그림 2B 및 표 2; p&0.01).

쥐의 뇌의 조직학적 검사는 도 3에도시되어 있다.

표 1: NSS, 체온, 지주 막증 출혈 및 사망률 평가. * p & 0.01

표 2: BBB 고장, 경색 영역 및 뇌 부종의 평가. * = p & 0.01

도 1: MCAO 모델 및 샴 조작 제어에 비해 부상 후 레이저 모델 24 h에서 뇌 손상의 평가. (A)경피량 평가. 레이저 모델의 극한부도가 샴 작동 제어(*p&0.01)에 비해 증가했습니다. 그러나 레이저 모델의 경포량은 MCAO 모델(*p&0.01)에 비해 작아졌다. (B)총 뇌 부종 평가. MCAO 모델에서 뇌 부종이 레이저 모델 또는 샴 조작 제어에 비해 증가했습니다. 레이저 모델과 가짜 작동 제어 사이의 뇌 부종에는 차이가 없었습니다. 데이터는 반구에 %로 측정되고 평균 ± SEM으로 표현됩니다.

그림 2: 가짜 컨트롤에 비해 BBB 고장의 정도입니다. (A)위반 (비 부상) 반구. 레이저와 MCAO 모델 모두, 샴 작동 제어 그룹 (*p&0.01)에 비해 비 부상 반구에서 BBB 파손의 상당한 증가를 주도. (B)입시탈탈(부상) 반구. 레이저 및 MCAO 모델에서 ipsilateral BBB 고장에 차이가 있었다 샴 작동 제어에 비해 (*p&0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 토끼, 레이저 및 MCAO 그룹에서 쥐의 뇌의 조직학적 검사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.