유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.
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방법 논문
엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.
여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.
서론
생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다1,,2,,3,,4,,5. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.
다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에....
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프로토콜
1. 양과성 엘라스틴과 같은 단백질의 설계 및 복제 (ELP)
- 다른 곳에서 설명한 대로 구성을 복제하고디자인합니다 8,,20. 플라스미드는 요청 시 이용 가능합니다.
2. 단백질 발현, 정제 및 준비
- F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현
- 하룻밤 사전 배양에서 0.3의 OD600까지 메인 발현 배양액을 접종합니다. 37°C에서 배양, 멸균 된 400 mL LB 배지에서 2 L 플라스크에서 적절한 항생제로 보충.
- 초순수에서 발현 배양의 유도를 위한 IPTG 스톡 솔루션(1M)을 준비한다.
- OD600 0.5-0.8에 도달하면 발현 배양에 IPTG를 추가하여 최종 농도인 1 mM을 추가하고 인큐베이션 온도를 20°C로 줄입니다. 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오.
- UAA pAzF를 포함하는 양과성 ELP의 발현
- 2개의 플라스미드 pEVOL pAzF 및 예를 들어 pET28-NMBL-(TAG)를 ....
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결과
소포 생산을 위한 프로토콜 개발
그림 1은 두 가지 다른 소포 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 좌측의 THF 팽윤 방법은 3개의 연속적인 단계로 구성되며 온도에 따라 ELP의 상이한 상이한 분자 어셈블리를 초래한다. 그림 1A 에피오레스내시크 현미경 이미지는 BDP-R20F20에서 조립된 소포와 BDP-R40F20에서 조립된 섬유소 구조를 보여줍니다. 오른쪽에 예시된 BuOH 방법은 ELP 소포의 형성을 독점적으로 유도하여 THF 팽윤 방법에 비해 약 2배의 더 많은 소포를 산출합니다. 도식 그림은 BuOH 소포의 준비 과정을 보여줍니다. 도 1B BDP-R40F20에서 소포 제제를 위해 10-15% (v/v) BuOH및 소포를 혼합하여 혼합물의 압출을 통해 제조하였다.
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토론
정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.
양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M의 우레아 농도는 양과성 ELP를 가장 잘 용해시키고 수용성 용출 분획에서 단백질 수율을 증가시키는 것으로 입증되었다. 용해 완충액에 있는 더 낮은 우레아 사격이 요구되는 경우에, 친화성 정제는 개별 구조물을 위해 시험되어야 합니다. 2 M 우레아는 특히 His-tag가 친수성 도메인에 융합되어 수지를 결합 할 수있는 일부 구조에 대해서도 잘 작동했습니다. 크기 배제 크로마토그래피를 통한 그의 태그 정제 후 추가적인 정제 단계는 소포 수율을 증가시킬 수 있다.
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 재정 지원을 위한 BMBF및 생물학 시스템 분석 센터 (ZBSA)를 위한 연구 시설을 제공하기위한 감사합니다. 우리는 P. G. 슐츠, TSRI, 라 호야, 캘리포니아, 플라스미드 pEVOL-pAzF를 제공에 감사드립니다. 우리는 알버트 루드비히스 대학 프라이부르크의 생물 학적 시스템 분석 센터 (ZBSA)의 생명 이미징 센터 (LIC)의 직원에게 공초점 현미경 자원에 대한 도움과 이미지 기록에 대한 탁월한 지원에 감사드립니다.
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| 50mL 팔콘 튜브 | VWR | ||
| 79249 알킨 메가 스톡스 염료 | 시그마 알드리치 | ||
| 빙하 | VWR | ||
| 아세토니트릴, 무수, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| 암피실린 나트륨 염, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| PES 멤브레인이 있는 병 상단 필터(45 &마이크로; m, 22 &마이크로; m) | Thermo Scientific | ||
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참고문헌
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....
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