여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.
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방법 논문
미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징
이 논문에서
요약
초록
성장과 형태 발생의 세포 및 조직 수준 조절을 이해하는 것은 수십 년 동안 생물학적 연구의 최전선에 있었습니다. 분자 및 이미징 기술의 발전으로 생화학 적 신호가 형태 유전학 적 사건에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 그러나 생화학 적 신호 외에도 기계적 단서가 세포 및 조직 성장의 여러 측면에 영향을 미친다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 아라비도시스 는 모든 지상 장기의 생성을 담당하는 돔 모양의 구조입니다. 식물 세포에서 아포가소성 셀룰로오스 증착을 중재하는 피질 미세 투덜유 세포 골격의 조직은 공간적으로 구별된다. 셀룰로오스는 식물 세포벽의 가장 단단한 성분이기 때문에 피질 마이크로투블러의 패턴의 시각화 및 정량적 평가가 SAM에서 세포의 생물물리학적 특성을 이해하는 데 필요합니다. 피질 마이크로투룰 조직의 고정관형 형태는 SAM에 존재하는 조직 전체의 물리적 힘의 결과이기도 합니다. 이러한 물리적 힘의 왜곡과 피질 마이크로 투튜브 조직의 후속 모니터링은 메카노 지각 및 트랜스포메이션을 중재하는 데 관련된 후보 단백질의 식별을 가능하게 합니다. 여기에서는 이러한 프로세스를 조사하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.
서론
식물 세포는 기계적으로 기계적 으로 변경할 수있는 섬유 강화 복합 재료와 유사한 다당류및 당단백질의 세포외 매트릭스에 의해포위된다 1. 식물 세포의 성장은 세포로 물의 섭취에 의해 구동되며, 이는 세포 벽에 인장력의 수반되는 축적을 초래합니다. 이러한 힘에 대응하여 세포벽의 물리적 상태를 수정하면 세포 팽창이 가능합니다. 1차 벽을 가진 세포는 주로 내다당류의 화학적 조성의 차이로 인해 세포를 포함하는 이차 세포벽에 비해 급속한 성장을 이룰 수 있다. 1차 벽세포는 당단백질 이외에 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성되며, 이차 세포벽2에존재하는 성분인 리그닌이 결여된다. 셀룰로오스, β-1,4 결합을 통해 연결 된 포도 당 고분자, 세포벽의 주요 구성 요소. 세포 성장3에서 경험된 높은 인장력을 견딜 수 있는 세브릴라 구조로 구성됩니다. 인장력을 견딜 뿐만 아니라, 우대 방향을 따라 기계적 보강은 셀룰로오스 마이크로피브릴의 순 방향에 수직인 축을 따라 터고 구동 팽창을 초래한다. 셀룰로오스 마이크로피브릴의 조직은 혈장 막4에위치한 셀룰로오스 합성 복합체의 방향 이동을 안내하기 때문에 피질 미세 투덜어 사이토스켈레톤....
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프로토콜
1. 식물 성장
- 뿌리 아라비도시스 씨앗은 녹색 형광 단백질 (MBD-GFP)10과 융합 된 미세 투불 결합 도메인을 토양에10 및 긴 하루 (16 h day / 8 박 밤), 발아를 위한 1 주일 동안 20 °C /6 °C 조건에 보관하십시오.
- 발아 후, 강력한 식물 성장을 허용하기에 충분한 성장 공간을 가진 새로운 냄비에 묘목을 전송합니다. 짧은 하루 (8 시간 /16 박 밤), 3-5 주 동안 20 ° C / 16 ° C 조건에 식물을 유지합니다.
- 긴 하루 (16 시간 / 8 박), 20 ° C / 16 ° C 조건으로 식물을 전송하고 식물 볼트 (2-3 주)까지 유지합니다. 꽃피는 2-5cm 길이까지 자랄 수 있습니다.
2. 중간 준비
- 작은 페트리 요리(폭 약 5.5cm, 깊이 1.5cm)를 2% 아가로즈로 깊이의 약 절반으로 채우어 해부 요리를 준비합니다. 해부 요리는 또한 단일 시간 포인트 이미징에 사용될 수 있습니다.
- 성장 매체를 준비합니다.
- 1,000x 비타민 스톡 용액 50mL, 니코티네산 0.05g, 피리독신 염산염 0.05g, 티아민 염산염 0.5g, 글....
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결과
도 1은 무질서한 피질 마이크로투풀을 포함하는 돔의 중심에 세포가 있는 MBD-GFP 선에서 얻은 일반적인 투영 영상을 나타내며, 주변의 세포는 일주분포(도 1A,B)를가지는 반면 경계 도메인 세포는 세포의 긴 축과 평행하게 정렬된 피질 마이크로튜브를 포함한다. 이러한 관측은 SAM의 다른 영역에서 피질 마이크로튜브의 공간 분포의 차이를 보여줍니다. 시간 경과 이미징은 고도로 무질서한 어레이에서 절제6 h(도 1C, D)내의 조직된 배열로 변화하는피질마이크로투블러 정렬을 보여 주었다. FibrilTool을 사용하여 생성된 텐서가 피질 마이크로튜블 이미지에 중첩될 수 있습니다. 더 긴 텐서는 이소트로피의 더 높은 정도를 나타냈다. 텐서는 또한 피질 마이크.......
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토론
기계 신호 변환 이벤트의 평가는 메카노 지각 및 트랜스듀션 경로에 관련된 분자 조절기를 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기서 설명된 프로토콜은 아기도시스 SAM에서 이러한 프로세스에 대한 판독으로 피질 마이크로튜뮬 반응을 사용하여 이러한 이벤트에 대한 정량적 보기를 제공한다. 여기서 설명된절차는 다양한 조직유형(16, 17,18,19)에서여러 연구에서 일상적으로 사용된다. microtubule anisotropy에 있는 중요한 증가는 모든 조직 모형에 있는 4 시간의 범위에서 관찰됩니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 자체 물이 세포의 터고 압력의 증가를 초래하기 때문에 미세 투부에 대한 변경이 물에 장기간 침수로 인해 발생하지 않도록.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 컨포칼 현미경 | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| 미세 기공 테이프 | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| 니코틴산 | Sigma | N4126 | |
| 플라스틱 힌지 박스 | 전자 현미경 과학 | 64312 | |
| PPM (식물 방부제 혼합물) | 식물 세포 기술 | PPM | |
| 요오드화 프로피듐 | 시그마 | P4864 | |
| 피리독신 염산염 | 시그마 | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| 티아민 염산염 | 시그마 | T4625 |
참고문헌
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
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재인쇄 및 허가
