프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
과학 계측의 공간 해상도 및 검출 감도의 발전으로 생물학적 및 화학 연구에 작은 원자로를 적용할 수 있습니다. 고성능 마이크로반응기의 수요를 충족하기 위해 펨토리터 액적 어레이(FemDA) 장치를 개발하고 대규모 병렬 세포 없는 단백질 합성(CFPS) 반응에서 적용을 예시했습니다. 2단계 오일 밀봉 프로토콜을 사용하여 손가락 크기의 영역 내에서 100만 개 이상의 균일한 물방울이 쉽게 생성되었습니다. 모든 액적은 친수성 바닥과 소수성 측벽으로 구성된 펨토리터 마이크로 챔버에 고정되었습니다. 하이브리드 소수성 소수성 구조와 전용 밀봉 오일 및 계면 활성제는 증발 손실없이 펨토리터 공간에서 펨토리터 수성 용액을 안정적으로 유지하는 데 매우 중요합니다. 펨토리터 구성과 FemDA 장치의 간단한 구조는 최소한의 시약 소비를 허용했습니다. 액적 반응기의 균일한 치수는 대규모 정량적 및 시간 과정 측정을 설득력 있고 신뢰할 수 있게 만들었습니다. FemDA 기술은 각 물방울에 있는 DNA 분자의 수와 CFPS 반응의 단백질 수율을 상관시합니다. 우리는 장치의 미세 제조, 펨토리터 방울의 형성, 현미경 이미지 데이터의 수집 및 분석에 대한 절차를 간소화했습니다. 최적화된 낮은 운영 비용을 갖춘 상세한 프로토콜은 표준 클린룸 시설과 기존의 형광 현미경을 갖춘 모든 사람이 FemDA 기술을 이용할 수 있게 합니다.
서론
연구원은 바이오/화학 반응을 수행하기 위해 반응기를 사용합니다. 원자로의 크기를 줄이고 시약 소비를 낮추면서 작업 효율을 높이기 위해 실험 처리량을 늘리기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있습니다. 두 측면 모두 연구원들을 무거운 작업부하에서 해방시키고 비용을 절감하며 연구 개발 속도를 높이는 것을 목표로 합니다. 우리는 반응 량과 처리량의 관점에서 원자로 기술의 개발에 대한 명확한 역사적 로드맵을 가지고 : 단일 비커 / 플라스크 / 테스트 튜브, 밀리리터 튜브, 마이크로리터 튜브, 마이크로리터 8튜브 스트립, 마이크로리터 96/384/1536웰 플레이트, 미세유체 나노리터/피콜리터/펨톨리터 반응기1,,2,,3,,4,,5,6,7.,7 지난 수십 년 동안 반도체 산업의 집적 회로 칩에 트랜지스터의 특징 크기를 축소하는 유사, 바이오 / 화학 마이크로 반응기는 볼륨 감소 및 시스템 통....
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프로토콜
1. 펨토리터 마이크로 챔버 어레이 기판의 미세 제조
참고: 클린룸에서 다음과 같은 미세 제조 실험을 수행합니다. 클린룸에 들어가기 전에 장갑과 클린룸 슈트를 착용하십시오.
- 커버 유리 기판 청소
- 커버 글래스 스테인닝 랙에 커버 글래스를 놓습니다. 커버 글래스를 8M 수산화나트륨(NaOH)에서 실온(RT)에서 15분 동안 초음파 처리합니다.
주의: 고농도의 NaOH는 피부와 눈에 매우 위험합니다. 스플래시 없이 부드럽게 처리하십시오. - NaOH 용액에서 랙을 꺼내 물을 사용하여 커버 유리를 10 번 헹구십시오. 커버 글래스를 순수한 물에 보관하십시오.
참고: 알칼리성 폐기물을 지정된 탱크에 폐기합니다. NaOH 용액은 원래 병으로 재활용할 수 있으며 최대 5회까지 사용할 수 있습니다. - 에어 블로우 건으로 커버 글래스의 각 조각을 건조시.
- 말린 커버 유리를 200°C에서 5분간 굽습니다.
- 커버 글래스 스테인닝 랙에 커버 글래스를 놓습니다. 커버 글래스를 8M 수산화나트륨(NaOH)에서 실온(RT)에서 15분 동안 초음파 처리합니다.
- 유리 표면의 실란화
- 드라이 스테닝 랙에 청소 된 커버 유리를 재설정합니다.
- PTFE 비커에 150mL의 에탄올을 넣습니다. 바늘(22G x 70mm)을 장착한 1mL 주사기를 사용하여 0.0....
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결과
미세 제조 공정은 기판 세척, 표면 기능화, CYTOP 코팅, 포토리소그래피, 드라이 에칭, 포토레지스트 스트리핑 및 최종 세척으로 구성됩니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 마이크로챔버 내부의소수성 CYTOP 폴리머를 완전히 제거할 수 있도록 허용하고, 표준 커버 유리 기판상에서 매우 병렬 성소수성 구조를 생성한다. 오일 밀봉 프로토콜의 도움으로, 생성된 액물의 균일한 치수는 마이크로챔버(도3B)에서형광용액을 캡슐화하여 검증하였다. 개발된 소프트웨어를 사용하여 추출된 형광 강도는 액적 크기의 좋은 지표입니다. 형광 강도의 CV, 3%, 전체 어레이(도3C)에걸쳐 액적 크기의 좁은 분포를 반영하였다. 공초점 현미경검사에서 재구성된 3D 영상도 시간이 지남에 따라 일관된 액적 부피를보였다(그림 3D,보충.......
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토론
FemDA의 매우 균일하고 안정적이며 생체 적합성을 기반으로 한 고정량 측정은 다른 연구와 는 다른 독특한 특징인 이산 분포를 가능하게 했습니다. 우리는 체계적으로 최적화하고이 논문에서 미세 제조 및 액적 형성 과정을 자세히 설명했다. 설정된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
첫째, 직사각형 얇은 유리 기판상의 고점성 CYTOP 폴리머의 균일한 코팅은 크게 결과 기판의 품질을 결정한다. 배율이 높은 객관적렌즈의 일반적으로 짧은 작동 거리를 감안할 때(단계 6.1 참조), 얇은 커버 유리를 사용해야 합니다. 얇고 유연한 기판에 고품질의 스핀 코팅은 일반적으로 까다롭습니다. 우리는 아직 가능한 모든 설계를 테스트하지 않았지만 동일한 직사각형 치수를 가진 다중 구멍 진공 척이 스핀 코팅에 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 커버 유리 기판의 중앙에 CYTOP 폴리머를 떨어뜨리고 즉시 스핀 코팅을 시작하는 것이 중요합니다(1.3.2 단계 참조). 난이도의 정도는 기판의 형상과.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 JP18K14260및 해양-지구 과학 기술에 대한 일본 기관의 예산에 의해 지원되었다. 특성화 시설을 제공해 주신 데구치 시게루(JAMSTEC)와 이쿠타 테츠로(JAMSTEC)에게 감사드립니다. 상용 소프트웨어 지원에 대한 다카이 켄(JAMSTEC)에 감사드립니다. 마이크로패브릭은 도쿄대학교 다케다 센탄치 슈퍼클린룸에서 실시되었으며, 일본 교육문화체육관과학부(MEXT)의 '나노기술 플랫폼 프로그램', 일본 보조금 번호 JPMXP09F19UT00087이 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (3-아미노프로필)트리에톡시실란 | 시그마-알드리치 | 440140 | |
| 1mL 주사기 | Terumo | SS-01T | |
| 2-프로판올 | 간토 케미컬 | EL 등급 | EL: 전자식. |
| 3D 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Lasertec | OPTELICS HYBRID | 다른 유사한 현미경(예: Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000)도 적용할 수 있습니다. |
| 50mL 주사기 | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | 디메틸 설폭사이드에 5mM 원액 준비 |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| 송풍기 | Hozan | Z-263 | |
| 알루미늄 블록 | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| 알루미늄 마이크로 튜브 스탠드 | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (테스트 샘플) | 무료 테스트 샘플은 AGC에 문의 할 수 있습니다. |
| BEMCOT PS-2 와이퍼 | Ozu | 028208 | |
| 플런저가 있는 생검 펀치 | Kai | BPP-10F | |
| 커버 유리 | Matsunami Glass | No. 1 (24mm × 32mm, 0.13~0.17mm 두께) | 크기 맞춤형. |
| 커버 유리 스테인링 락 | 나카야마 | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe 클린 와이퍼 | 일본 종이 크레시아 Crecia | C100-M | |
| 커팅 매트 | GE 헬스케어 | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| 탈기 믹서 | Thinky | AR-100 | |
| 탁상용 절단기 | 롤랜드 | STIKA SV-8 | |
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| 양면 코팅 접착제 캡톤 필름 테이프 | 테라오카 제작소 | 7602 #25 | |
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| 편평하 케이블 절단기 | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
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| 핫 플레이트 | AS | ONE TH-900 | |
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| PURExpress 체외 단백질 합성 키트 | New England Biolabs | E6800S 또는 E6800L | 무세포 단백질 합성 반응용. |
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| RNase 억제제 | New England Biolabs | M0314S | |
| 스카치 테이프 | 3M | 810-1-18D | |
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| 초음파 세척기 | AS ONE | ASU-2M | |
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참고문헌
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
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