여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도핀치 생검을 유도하고 실시간으로 상처 폐쇄를 추적하는 절차에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 또한, 상처 침대의 조직학적, 면역 조직 화학 및 분자 분석을 위한 조직의 제조를 위한 방법이 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
급성 부상 반응뿐만 아니라 상처 치유 과정에서 발생하는 조직 및 세포 변화를 이해하는 것은 위장관 (GI) 관의 질병을 연구 할 때 가장 중요합니다. 뮤린 식민지 핀치 생검 모델은 이러한 프로세스를 정의하는 유용한 도구입니다. 추가적으로, 창자 발광 함량 (예를 들면, 세균) 및 결장 사이 상호 작용을 공부할 수 있습니다. 그러나, 상처 유도 및 신뢰할 수 있는 방식으로 시간이 지남에 따라 상처 폐쇄를 추적 하는 능력은 어려울 수 있습니다. 더욱이, 조직 제제 및 방향은 조직학적 및 분자 변화를 최적으로 심문하는 표준화된 방법으로 수행되어야 합니다. 여기서는 생검으로 인한 부상과 반복대장내시경 검사를 통한 상처 폐쇄 모니터링을 설명하는 상세한 방법을 제시합니다. 상처 크기의 일관되고 재현 가능한 측정, 분자 분석을 위해 상처 침대를 수집하고 조직의 단면에 상처 침대를 시각화할 수 있는 능력을 보장하는 접근법이 설명되어 있습니다. 성공적으로 이러한 기술을 수행 하는 능력은 급성 부상 응답의 연구에 대 한 수 있습니다., 상처 치유 와 결장 내에서 발 광 호스트 상호 작용.
서론
위장관(GI)은 여러 기능, 숙주 세포 유형(예: 상피, 면역, 기질 등)뿐만 아니라 수조 개의 미생물을 고려할 때 복잡한 장기 시스템입니다. 이 복잡성에 비추어, 기관의 질병은 수시로 이 요인의 전부의 상호 작용을 관련시킵니다. 예를 들어, 염증성 장질환(IBD)은 염증성 세포, 이영양증 및 상피수리1,2,3,4,5,6,7의활성화를 포함하는 기관내 염증 및 완화의 주기와 관련이 있다. IBD 및 기장의 그밖 선동적인 조건을 연구하기 위하여 적당한 모형 시스템을 갖는 것은 질병의 병인을 해명하기 위하여 중요합니다. 여러 가지 모델은 유전적으로 조작된 마우스를 포함한 IBD 병인증을 연구하고 설치류8,9,10에서황산나트륨(DSS)과 같은 화학 물질의 사용을 연구하기 위해 존재한다. 이 모형의 한계는 정확하게 상처 치유를 평가하는 어려움뿐만 아니라 염증의 유도를 통제하는 무능력을 포함합니다. IBD 병기의 양상을 모방하는 대체 방법은 치료법 개발에 유용할 수 있습니다.
마우스의 대장내시경 유도 핀치 생검은 염증 반응, 상처 치유, 결장의 숙주 미생물 상호 작용의 병기 발생을 연구하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다. 이 접근법은 2009년에 실험 도구로 처음 사용되었으며, 이는 창자 11에서 급성 염증 반응 및 상처 치유를 연구하는 데 유용성을입증했습니다. 후속 연구는 대장 상처 치유11,12,13,14,15,16,17,18에서,대장 상처 치유에서, 장내 미생물뿐만 아니라 다른 신호 경로의 역할을 평가하기위해이기술을 활용. 최근에는 이 모델을 사용하여 대장 상해에 대한 급성 반응에서 스핑고신-1-인산염 신호 및 박테리아의 중요성을조사하였다. 유용하지만, 마우스에서 대장 내시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 장의 천공은 부상유도시 발생할 수 있으며 연쇄 대장 내시경 검사를 통해 상처 침대의 일관된 측정을 보장하는 것은 어려울 수 있습니다. 또한, 조직학적 또는 면역 조직화학 분석을 위해 상처 침대를 제대로 시각화하기 위해 대장 조직을 올바르게 지향하는 것은 어려울 수 있다. 이러한방법(18,20)에관한 일부 정보가 존재하지만, 이러한 기술에 대한 정확한 단계별 설명은 시각적 보조장치가 이 모델의 신뢰성과 더 넓은 유용성을 향상시킵니다. 여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도 핀치 생검을 실행하고, 시간이 지남에 따라 상처 폐쇄를 추적하고 상처 침대의 조직학 및 분자 분석을 가능하게 하기 위하여 조직을 준비하는 상세한 방법을 제시합니다. 이러한 기술을 수행하는 표준 방법을 만드는 것은 GI 염증 및 상처 수리에 잠재적으로 중요한 이전에 조사되지 않은 중재자를 연구하기 위해이 모델의 사용을 확장 할 수 있습니다.
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 절차는 Weill Cornell 의학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다." 에: "여기에 설명 된 모든 절차는 웨일 코넬 의학과 스토니 브룩 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 대장 내시경 검사 및 상처 유도
- 1.9mm 강성 보어 내시경을 칼집에 먼저 삽입하여 내시경의 성분을 미리 조립한다(도1A-B). 제공된 튜브를 이용하여 에어 펌프(대장 결핍을 제공하기 위해)를 작동 채널 옆 칼집의 왼쪽에 있는 가스 밸브에 부착한다(도1C).
참고: 여기에 설명된 렌즈는 0°이지만 이 목적을 위해 30° 렌즈를 사용할 수도 있습니다. - 작업 채널이 열린 위치에 있는지 확인하고 작업 채널을 통해 3 Fr 생검 집게를 삽입하고 칼집의 끝까지 진행 (칼집에서 튀어 나오지 않도록하는 동안)(도 1C). 조립된 내시경을 제조업체의 지침에 따라 광원 및 비디오 이미징 장치에 부착합니다.
- 유도 챔버에서 산소로 5 %의 이소플루란으로 마우스를 마취시화하십시오. 그런 다음 마우스를 복부 측에 가열 시스템(저체온증을 방지하기 위해)을 포함하는 내시경 스테이징 플랫폼으로 이동하고 산소가 있는 2%의 이소플루란을 사용하여 마취 하에 유지합니다. 마취 하에 건조한 것을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 추가하십시오. 마우스가 반사를 테스트하기 위해 뒤쪽 발을 부드럽게 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인합니다.
참고: 어떤 긴장 또는 마우스의 섹스이 기술로 사용할 수 있습니다.; 그러나, 마우스가 적어도 8주 이상이기 때문에 절차에 충분히 큰 것이 바람직하다.- 마취 하에 건조한 것을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 추가하십시오.
- 마우스가 반사를 테스트하기 위해 뒤쪽 발을 부드럽게 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인합니다.
- 실온 인산염 완충식식염(PBS)으로 연결된 쥐 게이지 바늘로 3mL 주사기를 채웁니다. 마우스 항문에 약 1cm 바늘을 삽입하고 부드럽게 배설물 물질을 제거하기 위해 PBS를 주입합니다. 여러 배설물 펠릿은 주입 된 PBS와 함께 마우스를 종료해야합니다.
참고: PBS의 과도한 부피의 주입은 루멘의 시야를 가릴 수 있는 루멘에 거품 형성을 초래할 수 있습니다. - 조립된 내시경을 마우스항문으로 0.5cm 삽입합니다. 집게의 전체 '턱'(힌지 포함)이 칼집의 끝을 넘어갈 때까지 생검 집게를 직장의 루멘으로 전진시키게 한다(비디오 모니터에서 관찰된 바와 같이)(보충 비디오 1). 동서 방향으로 턱이 열리도록 집게 90°를 돌립니다(추가비디오 1).
- 생검을 하려면 집게를 열고 약 1cm를 전진시키고, 집게를 닫고 한 번의 부드러운 동작으로 신속하게 집게를 뒤로 당기기(보충비디오 1).
- 생검을 수행 할 때 결장전체를 부풀리지 마십시오. 따라서, 이 단계에서 가스 밸브의 오른쪽을 열어 둡니다. 집게를 열면 결장이 위치에있을 때 점막을 손상시킬 위험이 있다는 점에 유의해야합니다.
2. 상처 침대의 시각화 및 측정
- 대장내시경 기록 장치에 부착된 발 페달을 눌러 생검 직후 비디오 녹화를 시작합니다. 가스 밸브의 오른쪽에 검지 손가락을 단단히 눌러 결장을 완전히 부결시켜 내시경으로 공기를 강제로 밀어 내시경으로 밀어 넣는 다.
참고: 이 프로토콜은 공기 흐름이 수동으로 제어되는 공기 펌프의 사용을 설명하지만 제어된 공기 공급장치가 있는 연동 펌프도 사용할 수 있습니다. - 집안에서 다시 집안일, 그리고 닫힌 위치에 있는 동안 직장 루멘으로 다시 포셉을 진행한다(보조비디오 1). 턱의 베이스가 시야의 상단 가장자리와 정렬 될 때까지 즉시 상처 위에 직장 벽에 집게를 배치(그림 2 및 보충 비디오 1). 상처의 명확한 보기를 관찰 할 때까지 결장완전히 팽창 계속.
참고: 내시경의 렌즈와 병변 사이의 일관된 거리를 보장하기 위해 검사되는 모든 마우스에 대한 집게의 턱만을 기초까지 나타낼 수 있을 만큼 충분히 포셉을 확장하여 주의해야한다(그림 2,흰색 화살표). - 같은 날 여러 마우스에 생검을 수행하는 경우, 포셉에서 이전 마우스의 생검 조직을 제거하고 (제공된 청소 브러시를 사용하여) 렌즈 칼집을 70 % 에탄올로 닦아 다음 마우스에 상처를 유도하기 전에 청소하십시오.
참고: 이 프로토콜은 마우스 당 단일 생검을 수행하는 것을 설명하지만, 이전 생검에서 채취한 조직이 후속 생검에서 전체 생검을 취할 수 있도록 하기 위해 집게에서 제거된 경우 단일 마우스에서 여러 생검을 수행할 수 있습니다. - 마우스를 다른 마우스의 케이지 보이드에 넣고 수건 위에 놓고 절차를 완료한 후 마취에서 회복될 때까지 기도를 깨끗하게 유지합니다. 마우스를 모니터링하여 활동을 회복하여 지시한 바와 같이 마취에서 회복되도록 합니다.
참고: 2명은 상처를 유도하고 0일째에 상처 침대를 시각화해야 합니다(내시경을 조작하는 사람과 다른 하나는 생검 집게를 작동함) 다음 날에 상처를 시각화하기 위해 한 사람만 필요합니다(아래 설명된 바와 같이). - 상처유도를 제외한 1.1-1.4항에서 상술한 바와 같이 후속 상처 측정(일반적으로 일 2, 4 및 6 다음 생검)을 위한 마우스 및 대장 내시경 검사를 준비하기 위한 동일한 절차를 따르십시오.
- 내시경을 삽입한 후 이 시점에서 비디오 모니터에 상처 침대를 찾아, 생검 집게(닫힌 위치)를 상처 침대 바로 위로 전진시키고, 결장 부전을 부풀리고, 2.1 및 2.2(그림2)에설명된 바와 같이 비디오 녹화를 시작한다.
참고 : 생검 후 6 일 이상 상처 침대를 찾기가 어려울 수 있습니다. - 다음 날에 는 내시경의 렌즈와 병변 사이의 일관된 거리를 며칠 간 일관된 거리로 유지하여 0일째와 동일한 거리로 이 다음 날에 집게를 루멘으로 전진시키세요. 렌즈와 병변 사이의 일관된 거리를 보장하면 시간이 지남에 따라 측정 정확도가 향상됩니다.
참고: 한 개인은 요즘 측정을 수행 할 수 있습니다 (내시경은 오른손으로 작동하고 생검 집게는 왼손으로 진행됩니다). - 모든 측정이 완료되면 비디오 편집 소프트웨어에서 연속 대장 내시경 사본의 비디오 녹화를 열어 비디오에서 스틸 샷을 생성할 수 있습니다.
- 상처 침대가 쉽게 시각화 될 수있는 시간을 보여주는 프레임에 비디오를 사전, 폐쇄 된 집게는 상처 침대 위에 직장 벽에 있고 벽이 팽팽하다. 이 프레임의 스냅샷을 찍고 파일 이름을 코딩하여 상처 침대의 측정이 눈먼 방식으로 수행되도록 합니다.
- NIH ImageJ에서 코딩된 파일 이름으로 이미지를 열어 상처 침대의 크기를 정량화합니다. 분석 탭에서 측정 설정을 선택하고 영역 확인란을 선택합니다.
- 메인 메뉴 모음에서 Freehand 선택 도구를 선택하고 상처 주위에 둘레를 그립니다(그림 2참조). 분석 탭에서 측정값을 선택하고 해당 측정 값이 결과 창에 자동으로 채워집니다.
- 결과 창 내의 파일 탭 아래에 있는 저장 As를 선택하고 확장을 스프레드시트 파일로 변경하여 모든 이미지에 대한 측정을 완료한 후 결과를 스프레드시트로 내보냅니다.
- 스프레드시트에서 0일째(상처 직후)의 크기에 비해 상처(즉, 일 2, 4 및 6일)의 유도 후 며칠 동안 상처의 크기를 계산합니다. 매일 상처의 크기를 0일째에 상처 크기로 나누고 그 값을 백분율로 변환하여 이 작업을 수행합니다.
참고: 이러한 대장내시경 보기를 사용하는 정상적인 조건에서, 상처의 가장 큰 폐쇄는 처음 2 일 후에 관찰된다 (~75% 크기 감소) 일 4 및 6 일에 더 점진적 폐쇄와 (~80% 및 ~95% 크기 감소) 각각 감소).
3. 분자 분석을 위한 상처 침대 의 수집
- CO2 질식을 사용하여 마우스를 안락사한 다음 생검 다음 날 선택한 날에 자궁 경부 탈구 (또는 동등한 기술)가 뒤따릅니다.
- 피부와 복부 근육을 열어 결장의 탈구 부위를 수확하여 신체 구멍을 노출시하십시오. 결장 아래에 닫힌 가위를 놓고 부드럽게 들어 올려 기본 장간에서 풀어 낸 다음 중간점과 항문에서 결장절단을 잘라 마우스에서 제거합니다.
- 얼음 차가운 1x PBS로 채워진 20mL 주사기에 부착된 쥐 게이지 바늘을 사용한 후 결장위에 놓인 후 필터 용지에 놓습니다.
- 필터 용지에 결장 개방을 세로로 잘라 서 막연한 면이 필터 용지에 대 한 아래로 얼굴을 확인 합니다. 조직이 필터 용지에 여전히 있는 동안 스퀴즈 파이프를 사용하여 점막에 0.2% 메틸렌 블루를 적용한 다음 과도한 메틸렌 블루를 배출합니다. 해부 현미경으로 결장내를 보고 상처 침대를 찾습니다(그림3A).
- 4인치 마이크로 아이리스 가위를 사용하여 상처 침대의 가장자리를 잘라(그림 3A,대시 원) 근육 층으로 절단하지 않도록주의 (근육이 원하지 않는 한) 스냅 동결 또는 원하는 저장 방법에 대한 미세 포인트 핀셋을 사용하여 튜브에 해부 상처 침대를 전송.
참고: 이러한 방식으로 수집된 조직의 양은 RNA-seq 또는 동등한 분석을 위해 RNA를 추출하기에 충분합니다.
4. 조직학적 분석을 위한 조직 준비
- 마우스를 안락사시키고 3.1-3.2 단계에서 설명한 대로 결장수확.
- 필터 용지에 결장 개방을 세로로 잘라 서 막연한 면이 필터 용지에 대 한 아래로 얼굴을 확인 합니다. 스퀴즈 파이프를 사용하여 4 % 파라 포름알데히드 (또는 선택의 고정)를 부드럽게 바르고 파라필름으로 조직을 덮습니다. 밀봉된 용기에 4-6시간 동안 평평하게 둡니다.
- 저장을 위해 조직을 70%에탄올로 전송합니다. 조직을 처리 할 준비가되면, 파라 필름을 제거하고 조직이 필터 종이에 여전히있는 동안 스퀴즈 파이프를 사용하여 점막에 0.2 % 메틸렌 블루를 적용합니다. 그런 다음 여분의 메틸렌 블루를 빼냅니다.
- 해부 현미경으로 결장내를 보고 상처 침대를 찾습니다(그림3A). #10 블레이드가 있는 메스를 사용하여 상처 침대의 중심을 직접 절단하고 결장이 반으로 절단된 직선으로 결장의 나머지 부분을 계속절단하여(도 3A,블랙 라인).
- 결장을 처리한 다음 파라핀을 포함시킨 다음(절단 후 남아있는 한쪽 또는 양면)을 메스에 의해 절단된 측면(양단 전에 상처 침대의 중심이었던 측면)이 파라핀에서 아래로 향하게 된다. 원하는 얼룩 또는 메이커에 대한 절단 섹션과 염색으로 진행합니다.
- 주어진 염색에 대 한 극저 분면 이 필요한 경우, 단계 3.1에 설명 된 대로 결장 수확 하 고 필터 용지에 세로로 열어, 백진측 필터 종이에 대 한 아래로 직면 보장.
- 4.5단계에서 설명된 바와 같이 갓 수확한 결장 내의 상처 침대를 양분하고 결장(절단 후 남아있는 한쪽 또는 양면)을 포함시켜 메스에 의해 절단된 측면이 조직 동결 매체로 반으로 채워진 기저금형에 엎드려있다.
- 미세 핀셋으로 조직을 고정하고 냉동 매체를 경화시키기 위해 마른 얼음 위에 금속 판에 베이스 몰드를 놓습니다. 배지의 바닥 부분이 동결되면(그리고 조직이 제자리에 고정되고), 조직을 방출하고 베이스 몰드의 남은 부피를 동결 배지로 채우고 드라이 아이스에 다시 놓습니다.
- 동결 매체의 전체 부피가 동결된 후 단면까지 -80°C 냉동고로 옮춥시다.
- 파라핀 또는 냉동 섹션의 경우 H&E에 의해 추가 섹션을 잘라서 염색하여 상처 침대가 연구 별 염색을 진행하기 전에 섹션에 캡처되었는지 확인합니다. 도 3B는 상처 침대가 명확하게 관찰 될 수있는 섹션의 예를 나타낸다.
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결과
생검을 수행하는 데 필요한 작은 항목 (렌즈, 칼집, 생검 집게)은 이러한 구성 요소의 적절한 조립 지표와 함께 도 1에 표시됩니다. 도 2는 상처 침대의 크기와 상처의 폐쇄 속도를 정확하게 정량화하기 위해 상처 침대의 허용 가능한 뷰의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 상처 침대의 전 생체 보기의 예는 상처 침대의 둘레의 지표를 포함하는 도 3A (분자 분석을 위해 소비하는 영역을 나타내는) 및 단면시 상처 침대의 시각화를 가능하게하기 위해 조직을 절단하는 위치를 포함하는 도 3A에 도시된다. 도 3B는 상처 침대를 명확하게 관찰할 수 있는 H&E 염색 섹션의 대표적인 이미지를 나타낸다. 보충 비디오 1마우스결장 내부에서 생검 시술을 볼 수 있습니다.
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토론
이 모델에서 상처 폐쇄 속도를 효과적으로 평가하려고 할 때 일관되고 정확한 생검과 상처 크기의 측정을 보장하는 것이 가장 중요합니다. 따라서 절차가 올바르게 수행되고 있음을 확신하기 위해 몇 가지 조치를 취해야 합니다. 첫째, 생검의 깊이가 너무 얕거나 깊어서는 안됩니다. 너무 얕으면 상처 닫기를 평가하기에 충분한 창이 없습니다. 그림 2는 0일째에 최적의 생검 깊이와 크기를 보여줍니다. 상처 침대 주위점막과 상처 침대 아래에 남아있는 조직 사이의 명확한 구별을 주의하십시오(그림 2). 생검이 너무 깊으면 천공이 발생하여 귀중한 마우스가 생길 수 있습니다. 0일째생검 후 부속이 발생하면 마우스의 복부가 심하게 변태되면 천공이 발생하고 마우스를 평가에 사용할 수 없으며 안락사되어야 합니다. 동일한 개인이 일관성을 더 보장하기 위해 주어진 연구에 대한 생검을 수행하는 경우 도움이됩니다. 둘째, 더 근위 부위가 아닌 직장에서 생...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 크론과 대장염 재단(D.C.M)과 뉴욕 크론재단(D.C.M 및 A.J.D.의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 이 기사에 비디오 반주를 만드는 데 도움을 준 카르멘 페라라 양에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 생검 겸자, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview 타워 시스템 | Karl Storz | 연락처 회사 | |
| 검사 칼집, 9 Fr, 키트 | Karl Storz | 61029DK | |
| 홉킨스 망원경, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| 이소플루오란 | Covetrus | 2905 | |
| 메틸렌 블루 | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| 마이크로 아이리스 가위 | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/ | A 소프트웨어는 다음에서 무료로 다운로드할 수 있습니다: |
| https://imagej.nih.gov/ij/ Pawfly MA-60 수족관 펌프 | 아마존 | N/A | |
| 스칼팔 #10 블레이드 | Hill-Rom | 372610 |
참고문헌
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