암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
암은 유전 불안정성, 돌연변이 및 환경 및 그밖 긴장 요인에 의해 시작된 세포의 통제되지 않는 증식 때문에 생깁니다. 복잡한, 다층 분자 신호 네트워크에서 이 취득한 이상은 비정상적인 세포 증식 및 생존, 세포외 매트릭스 분해 및 먼 기관에 전이를 유도합니다. 암 관련 죽음의 대략 90%는 전이성 보급의 직접 또는 간접적인 효력에 기인하기 위하여 추정됩니다. 따라서 유전 적 및 환경 적 조작에 따라 암 세포 행동을 특성화하는 매우 신뢰할 수있는 포괄적 인 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템은 암 전이의 분자 조절에 대한 명확한 이해와 계층화 되고 정확한 치료 전략의 성공적인 개발을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 그러므로, 유전자의 기능의 이득 또는 손실과 가진 이동 및 침략과 같은 암세포 행동의 정확한 측정은 암세포의 공격적인 본질의 평가를 허용합니다. 세포 임피던스를 기반으로 한 실시간 측정 시스템을 통해 연구원은 전체 실험 중에 지속적으로 데이터를 수집하여 다양한 실험 조건에서 결과를 즉시 비교및 정량화할 수 있습니다. 기존의 방법과 달리 이 방법은 마이그레이션하거나 침입하는 셀을 분석하기 위해 고정, 염색 및 샘플 처리를 필요로 하지 않습니다. 이 방법 논문은 교모 세포종 암세포의 이동 및 침입의 실시간 측정을위한 상세한 절차를 강조한다.
서론
암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 암 유전자형 및 표현형을 결정하는 것은 효과적인 치료 전략을 이해하고 설계하는 데 매우 중요합니다. 암 연구의 수십 년은 암 유전자형 및 표현형을 결정하기 위하여 다른 방법의 발달 그리고 적응으로 이끌어 냈습니다. 최신 기술 개발 중 하나는 세포 임피던스에 기초한 세포 이동 및 침입의 실시간 측정입니다. 기질 및 세포 세포 접촉에 대한 세포 접착은 세포 간 통신 및 조절, 개발 및 조직의 유지 보수에 중요한 역할을 합니다. 세포 접착의 이상은 세포 접촉의 손실로 이끌어 내고, 세포외 매트릭스 (ECM)의 저하, 세포에 의한 철새 및 침입 능력의 이득, 모두는 다른 기관에 암세포의 전이에기여1,,2. 세포 이동(상처 치유 및 보이든 챔버 분석)과 침략(Matrigel-Boyden 챔버 분석)3,,4,,5를결정하는 다양한 방법이 사용 가능하다. 이러한 종래의 방법은 세포 표현형을 측정하기 위해 실험 전후에 형광 염료 또는 기타 염료로 표지되어야 하기 때문에 반정적이....
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프로토콜
참고: 모든 세포 배양 물질은 멸균되어야 하며 전체 실험은 멸균 조건하에서 생물 안전 성 캐비닛에서 수행되어야합니다.
1. U-118MG 교모세포종 세포선의 배양 및 전기화
- U-118MG 세포주를 5% 태아 소 혈청(FBS)에서 배양하여 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)(배양 배지)를 함유하고 5%CO2 인큐베이터(culture conditions)를 함유하는 습한 분위기에서 37°C에서 유지한다.
- 전기 천공에 70- 80% 컨립 건강 세포를 사용하십시오.
- 수확 세포를 위해, 1x PBS로 배양 접시에서 성장하는 세포를 세척하고 0.05 % 트립신-EDTA의 2 mL을 추가합니다. 인큐베이터에 30 s를 놓고 트립신-EDTA를 제거합니다. 배양 배지에서 세포를 15 mL 튜브로 수집하였다.
- 핸드헬드 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산하고, 100 x g에서 원심 분리 세포를 5 분 동안 계산하고, 상급을 폐기한다.
- 배양 배지에서 세포 펠릿을 중단하고 각 조건에 대해 600,000개의 세포를 미세원원지 튜브로 취합니다. 실험 설계 및 성장 속도에 따라 세포 수를 조정합니다. ....
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결과
Crk 및 CrkL은 상이한 암 세포주13,,17에서세포 이동 및 침입에 중요하다고 제안되었다. Crk 및 CrkL 단백질은 구조적으로 그리고 기능적으로 서로 유사하고 필수적인 중첩함수16,,19,,20,,21을재생하지만, Crk 및 CrkL에 대한 많은 유전자 녹다운 연구는 Crk, CrkL 또는 둘 다에 특이적인지 명확하게 다루지 않았다. 따라서, 두 단백질 중 어느 것이 세포 이동 및 침입에 기여하는지는 불분명하다. 원리 증명 연구로, 우리는 Crk 또는 CrkL에 특정 siRNAs를 사용하고 U-118MG GBM 세포주의 이동 및 침략에 대한 그들의 효력을 공부했습니다. Crk의 녹다운은 C.......
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토론
실시간 셀 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 침입의 실시간 측정은 단일 시점에서 데이터를 제공하는 기존의 방법에 비해 여러 가지 중요한 장점을 가진 간단하고 빠르며 지속적인 모니터링 프로세스입니다. 기존의 방법과 마찬가지로, 각 세포주들은 기질, 성장, 세포 간 접촉, 및 철새에 대한 접착측면에서 다를 수 있기 때문에 실시간 세포 분석 시스템을 위한 각 세포주마다 실험 조건을 최적화해야 하며, 침략적 능력. 이러한 차이로 인해, 각 세포주들은 상이한 세포 역학 및 세포 임피던스를 나타낼 수 있다. 임피던스는 우물에서 시드된 세포의 수, 세포 접착 시간, 세포가 이동또는 침입하기 시작하기 전의 지연 시간, CIM 플레이트에서의 ECM 겔 농도에 의해 크게 영향을 받습니다. 첫째, 실시간 세포 분석은 특정 기간에 걸쳐 실시간으로 결과를 제공하기 때문에 최적화를 쉽게 만들어, 연구원은 제어 세포가 활성 세포 이동 및 침입을 표시할 때 및 제어 할 때 시간을 식별 할 수 있습니다 세포는 이주와 침략의 최대 수준에 도달합니다. 둘째,.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 실시간 세포 분석 시스템 데이터에 대한 그녀의 기술 지원에 대한 올리비아 펑크 에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고를 편집 어린이 자비 캔자스 시티의 의료 쓰기 센터에 감사드립니다. 이 작품은 소아암 연구를위한 톰 Keaveny 부여 기금에 의해 지원되었다 (TP에) 어린이 자비 병원 중서부 암 얼라이언스 파트너 자문 위원회 자금 (TP에).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 생물 안전 캐비닛 | ThermoFisher Scientific | 1300 시리즈 클래스 II, 유형 A2 | |
| CIM 플레이트 | Agilent Technologies, Inc의 세포 분석 부서 | 5665825001 | 세포 침입 및 이동 플레이트 |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 및 ID: 3524 | |
| 둘베코' s 변형된 독수리' 세포 | 배양에 사용되는 | ATCC | 302002 |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | 세포 세척에 사용되는 Gibco | 21-031-CV | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터 | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 인큐베이터 |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | 세포외 매트릭스 겔 |
| 네온 전기천공법 시스템 | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | 전기천공법 시스템 |
| 네온 형질주입 시스템 10 µ L kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeted siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | non-targated control용 siRNA |
| Odyssey CLx (이미징 시스템) | LI-COR Biosciences | 웨스턴 블롯 이미징 시스템 | |
| RTCA 소프트웨어 | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 실험 | |
| 에 사용되는 기기Scepter | Millipore | C85360 | 휴대용 자동 세포 계수 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | 실험에 사용되는 세포주 |
| xCELLigence RTCA DP | 세포 분석 부서 Agilent Technologies, Inc | 380601050 | 실험에 사용되는 기기 |
참고문헌
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144
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재인쇄 및 허가
