방법 논문

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

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DOI:

10.3791/60998

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2020년 4월 9일

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1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

이 논문에서

요약

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

초록

2차원(2D) 세포 배양은 생체 내 종양 성장을 만족스럽게 모방하지 않는다. 따라서 3차원(3D) 배양 스페로이드 모델이 개발되었습니다. 이 모형은 신경 종양학의 필드에서 특히 중요할지도 모릅니다. 실제로 뇌종양은 건강한 뇌 환경을 침범하는 경향이 있습니다. 본명은 종양 침범을 연구하기 위해 개발한 이상적인 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석기를 기술한다. 우리는 이 분석방법을 성공적으로 수행하기 위해 모든 기술적 세부 사항과 분석 도구를 제공합니다.

서론

1 차 또는 상업적으로 이용 가능한 세포주를 사용하여 대부분의 연구 결과에서는, 단층 배양으로 플라스틱 표면에 성장한 세포에 공아학은 수행됩니다. 2D에서 세포 배양을 관리하는 것은 생체 내 3D 세포 환경을 모방하지 않기 때문에 단점을 나타낸다. 2D 배양물에서, 전체 세포 표면은 배지와 직접 접촉하여 세포 성장을 변화시키고 약물 가용성을 수정한다. 또한, 비 생리학적 플라스틱 표면은 세포 분화를 유발한다1. 이러한 어려움을 극복하기 위해 3차원 배양 모델이 개발되었습니다. 그(것)들은 종양2의다세포 건축 및 이질성을 모방하는 이점이 있고, 따라서 고형종양3를위한 더 관련성 있는 모형으로 여겨질 수 있었다. 스페로이드의 복잡한 형태는 약물 침투및 내성을 더 잘 평가하는 데기여합니다 4. 스페로이드에서의 종양 이질성은 산소 및 영양소의 확산에 영향을 미치고, 약리작용제에 대한반응(도 1A). 산소의 확산은 스페로이드 크기가 300 μm에 도달하면 변경되어 스페로이드 의 중심에 저산소 환경을 유도합니다(그림 1A,C). 대사 산물은 또한 세포 층을 통해서 더 적은 관통및 보상 신진 대사 반응이 일어난다5. 스페로이드의 직경이 증가하면, 괴사 코어가 관찰될 수 있고, 공격적인 뇌암 교모세포종(GBM)을 포함하여 많은 고형암에서 발견되는 특성을 더욱 모방한다6.

교모세포종에 대한 몇몇 2D 또는 3D 침략 검칙은 문헌7,,8에보고되었다. 2차원 분석실험은 주로 얇은 매트릭스 층 또는 보이든 챔버 분석기에서 수평 평면에서 침략을 연구하기 위한 것이다9. 3차원 실험은 고전적인 교모세포종세포주(10)를사용하여 3D 스페로이드 배양물로 기재되었다. 보다 복잡한 변이체는 대립배양체 11에서종양 스페로이드에 의한 뇌 오르가노이드의 침입으로 표현된다. 그러나, 어떤 실험실든지 에 유효한 사용하기 쉬운 및 재현가능한 분석분석기를 개발하는 것이 아직도 중요합니다. 우리는 환자 샘플에서 교모세포종 줄기 와 같은 세포를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 분석법의 정량화는 쉽게 관리할 수 있으며 개방형 온라인 소프트웨어만 필요합니다. 간단히, 종양 조각은 작은 조각으로 절단하고 효소 소화. 소화에서 파생 된 단일 세포는 신경 기 저 기 에서 재배 됩니다. 4-7 일 후에 스페로이드 구조가 자발적으로 형성됩니다. 마우스 모델에서 두개내 이식 시, 그들은 의사 팔리사딩 세포(12)에둘러싸인 괴사 코어를 나타내는 종양을 형성한다. 이것은 GBM 환자에서 찾아낸 특성과 밀접하게 유사합니다.

이 문서에서는, 우리는 재현성을 보장하기 위해 결정된 수의 세포에서 스페로이드를 생산하는 우리의 프로토콜을 설명합니다. 두 개의 상보적인 행렬이 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다: Matrigel 및 콜라겐 모형 I. Matrigel는 성장 인자에 풍부하고 세포 부착 및 이동을 위해 요구되는 포유류 기저 막을 모방합니다. 다른 한편으로는, 기질의 구조적인 요소인 콜라겐 타입 I은, 가장 일반적인 섬유질 세포외 매트릭스이고 세포 침략 검정에 이용됩니다. 본 명세서에서, 우리는 이동 및 증식 아세술을 수행함으로써 GBM 스페로이드 모델을 설명한다. 분석은 고정된 시점에서뿐만 아니라 라이브 이미징에 의한 스페로이드 팽창 및 세포 움직임을 모니터링하여 수행되었습니다. 또한, 전자 현미경 검사는 형태학적 세부 사항을 시각화하기 위하여 행해졌습니다.

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프로토콜

통보 된 서면 동의는 모든 환자 (지역 윤리위원회 규정에 따라 노르웨이 베르겐 하우켈랜드 병원에서) 얻었습니다. 우리의 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 균일 한 크기의 종양 스페로이드의 생성

참고: 줄기형 세포는 이전 기사12에기재된 바와 같이 B27 보충제, 헤파린, FGF-2, 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충하는 신경기저 배지에서 배양된다. 이 세포는 문화에서 자발적으로 스페로이드를 형성합니다.

  1. 종양 세포를 5 mL 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 0.5-1 mL 해리 효소로 세포를 인큐베이팅 (재료 표참조)에서 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
  2. 4-4.5 mL PBS로 세척하고 완전한 성장 배지 (완전한 신경 기저 배지, cNBM)의 10 mL를 추가합니다.
  3. 트라이판 블루와 셀 카운팅 챔버 슬라이드와 자동 카운팅 기술을 사용하여 세포를 계산합니다.
  4. 스페로이드 당 10개의 4 세포 (바람직한 크기에 따라)로 100 개의 스페로이드를 생성하려면 NBM 8 mL에서 106 세포를 2 % 메틸 셀룰로오스 2 mL과 혼합하십시오.
  5. 서스펜션을 멸균 시스템 용기로 옮기고 멀티채널 파이펫으로 100 μL/well을 96개의 잘 둥근 바닥 판에 분배합니다.
  6. 플레이트를 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양합니다. 동일한 크기의 스페로이드가 형성되며 3-4 일 후에 사용할 수 있습니다.

2. 3차원 실험

  1. 확산
    1. 준비
      1. 억제제(예를 들어, 도4A에서와같이 로테네)와 화학물질을 배지의 100 μL에 첨가하고 각 웰(즉, 웰당 1개의 스페로이드)에 배지의 100 μL을 첨가한다.
      2. 플레이트를 37°C, 5%CO2및 95% 습도에서 배양합니다.
    2. 이미지 수집 및 분석
      1. 밝은 필드에서 비디오 현미경으로 사진을 찍어 T0과 다음 시간에 일련의 조건을 만듭니다.
      2. 피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드 코어 주위에 원을 그리고 각 스페로이드의 면적을 측정합니다. 이미지를 반자동화된 방식으로 분석하려면 //Core 영역만 사용하여 보충 문서 1에 표시된 매크로를 사용합니다.
  2. 침공
    1. 준비
      1. 1 mg/mL 최종 농도에서 I형 콜라겐, 1x PBS, 0.023xV콜라겐,1 M 수산화 나트륨, 멸균H2O. 용액을 얼음 위에 30분 동안 인큐베이션하여 얼음 위에 콜라겐 매트릭스를 준비시다.
      2. 500 μL 튜브에서 둥근 바닥 웰 플레이트에서 스페로이드를 수집하고 200 μL 1x PBS로 2x를 세척합니다.
      3. 스페로이드를 콜라겐 매트릭스의 100 μL로 조심스럽게 파이펫하고 정상 96 웰 플레이트의 웰 중앙에 삽입합니다.
      4. 콜라겐 젤을 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 젤 위에 cNBM을 추가합니다. 억제제 또는 활성제(예를 들어, 도 4B, 4C에도시된 염화수소)는 이 단계에서 배지에 첨가될 수 있다.
    2. 이미지 수집 및 분석
      1. 콜라겐 포함 후 24시간 동안 브라이트필드 모드에서 비디오 현미경으로 순차적으로 사진을 찍습니다.
      2. 피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드의 코어 및 전체 영역을 그리고 코어 영역을 뺀 값으로 각 스페로이드의 침습 영역을 측정합니다. 반자동화 된 방식으로 이미지를 분석하려면 보충 문서 1에 표시된 대로 매크로를 사용하여 침습 영역을 결정합니다.
  3. 마이그레이션
    1. 준비
      1. 37°C에서 30분 동안 NBM에서 마트리겔(0.2 mg/mL)으로 6개의 웰 플레이트를 코팅한 다음, 마트리겔을 제거하고 cNBM 2 mL을 추가합니다.
      2. 원형 바닥 웰 플레이트로부터 6웰 플레이트로 50 μL의 cNBM으로 스페로이드를 옮김을 전달한다.
      3. 37 °C에서 플레이트를 배양하고 스페로이드가 부착 될 때까지 30 분 기다립니다.
      4. 배양 24시간 후, Hoechst의 10 ng/mL로 얼룩을 내고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    2. 이미지 수집 및 분석
      1. 밝은 시야에서 비디오 현미경을 사용하여 이미지를 가져옵니다. 405 nm 레이저는 Hoechst 염색의 시각화에 사용됩니다.
      2. 피지 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석하고 보조 문서 1에표시된 대로 매크로를 실행합니다.
        참고 : 우물의 바닥을 만지거나 상급체를 완전히 제거하면 스페로이드가 손상됩니다. 콜라겐 타입 I 젤 취급의 경우, 콜라겐 중합을 피하기 위해 얼음 위에 젤을 보관하고, pH의 변화가 젤의 소형화에 영향을 미치기 때문에 산성 성분을 첨가하지 말고, 피펫 세포를 콜라겐내로 급속히 주입하여 세포 사멸 및 겔의 분해를 방지한다.

3. 피지 매크로

참고 : 피지는 이미지 분석 속도를 매크로의 개발을 할 수 있도록 공개 도메인에서 개발 된 이미지 분석 프로그램입니다. 수동 분석도 가능하지만 이는 느린 프로세스이며 편향을 유발할 수 있습니다. 이미지는 소프트웨어의 끌어서 놓기로 가져오고 ROI 관리자 도구 플러그인으로 정량화할 수 있습니다. 이 연구에서 사용되는 절차는 아래에 설명되어 있습니다.

  1. 매크로 창 열기: 플러그인 | 매크로 | 대화 형 인터프리터.
  2. 다음에 적용된 보라색 루프를 복사하여 붙여넣습니다. 보라색 문장을 유지하고 관심의 녹색 문장을 추가(보충 문서 1).
  3. 전체 계열을 분석하려면 특정 정량화를 위해 매개 변수를 빨간색으로 조정하고 매크로를 사용하여 매크로를 실행합니다 | 매크로를 실행하거나 Ctrl+R을 누른다.
  4. 필요한 경우 ROI(관심 영역)를 수동으로 조정합니다.

4. 스페로이드의 전자 현미경 검사법

참고: 다음 단계의 대부분은 화학 적 후드에서 수행해야합니다.

  1. 고정 단계
    1. 절단 피펫 팁으로 스페로이드를 수집하고 1.5 mL 튜브에 넣고 0.1 M 인산 완충제 (PB)로 1x를 씻습니다.
    2. 0.1 M PB에서 2% 글루타랄데히드/2% 파라포름알데히드(PFA)에서 4°C에서 하룻밤 동안 스페로이드를 고정시다.
    3. 고정 용액을 0.1 M PB에서 1% PFA 의 용액으로 교체한 다음 샘플 전공을 수행합니다.
  2. 샘플 준비
    1. 스페로이드를 스트레이너로 옮기고 스페로이드 손상을 피하기 위해 유리 비커에 넣습니다.
    2. 0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.
    3. 어둠 속에서 2 시간 동안 오스뮴으로 배양하십시오. 1% 0.1 M PB 완충액에서 4%로 오스뮴을 희석한다.
    4. 0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.
      1. 다음과 같이 탈수: 10분 동안 50% 에탄올, 10분 동안 70% 에탄올, 15분 동안 2x 90% 에탄올, 20분 동안 2x 100% 에탄올, 30분 동안 2x 아세톤에 담가 주세요.
    5. 샘플을 아세톤/수지 의 50/50 혼합물에서 2 시간 동안 배양합니다. 이 단계에서, 에폰 수지 (포함-812 : 11.25g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).
    6. 아세톤/수지 혼합물을 버리고, 갓 준비한 수지로 대체하고 밤새 배양하십시오.
    7. 수지의 새 것으로 교체하고 2-6 시간 사이에 배양하십시오.
    8. 48-72 시간 동안 60 °C에서 금형에 수지의 스페로이드를 추가합니다.

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결과

스페로이드는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고 이동, 침략, 증식 및 현미경 검사법에 관한 관찰이 이루어졌다. 구형 구조의 별개의 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 카르복식 아히드라아제 IX 염색을 저산소 활성을 결정하는 데 사용하였다(도1A-C). 더 많은 CAIX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다(그림1A-C). 스페로이드 코어에 위치한 저산소 세포는 주변 세포보다 더 당화성인 경향이 있습니다. 미토콘드리아는 전자 현미경검사법에 의해 도시된 바와 같이 추가 분석을 위해 이미지화될 수있다(그림 1Ba-1Bb). 2.5 x 103,5 x 103,104,

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토론

종양 스페로이드 세포 반응은 세포 사멸 및 약물 반응뿐만 아니라 증식, 침습 및 이동을 포함한 종양 특성을 연구하기 위해 잘 적응된다. 암세포는 그림 4B,C에서볼 수 있듯이 침습성 미세 종양을 형성하는 3D 매트릭스를 침범합니다. 침습 적 과정 동안, 매트릭스 금속 단백질 효소 (MMP) 종양 세포(13)및 MMP 억제제 (예를 들어, GM6001 또는 Rebimastat)를 둘러싼 다이제스트 매트릭스는 세포 침략을 손상시킬 수 있지만 이동(14). 이주와 침략은 우리의 스페로이드 분석에서 공부될 수 있는 겹치지 만 별도의 분자 사건15를관련시킵니다. 이렇게 하기 위하여는, 특정 신호 통로는 유전 수준에서 또는 약리학적인 금지를 통해 표적으로 할 수 있습니다.

교모세포...

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공개 사항

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 트랜스 칸 에 의해 지원되었다 2017, ARC 2017, 리그 콘트르 르 암 (코미테 드 라 지롱드 에 드 라 샤랑테 - 해양). 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원 (CHU 툴루즈)에서 펠로우십의 수혜자입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96 웰 라운드 바닥 플레이트Falcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-014 °에 보관; C, 구 해리 효소
B27Gibco12587-20 °에 저장; C, 사용 전 해동
기본 섬유아세포 성장 인자Peprotech100-18B-20 °에 저장; C, 사용 전 해동
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드InvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-5004°C에 보관; C
피지 소프트웨어ImageJ사진 분석에 사용
Flask 75 cm2Falcon10497302
MatrigelCorning354230-20 °에 저장; C, 저온 NBM
메틸셀룰로오스시그마M0512, NBM에서 2% 최종 농도
NBMGibco21103-0494°C에 보관; C
Neurobasal 매체Gibco211030494 °에 저장; C
페니실린 - 스트렙토마이신Gibco15140-122에 저장; C
Trypan 블루 0.4%ThermoFisherT10282세포 계수에 사용
유형 I 콜라겐코닝3542364°°C에 저장; 씨
에서 최종 농도 0.2 mg/mL로 희석, 4°C

참고문헌

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  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).

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3DFijiCarbonic Anhydrase IX

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