방법 논문

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

DOI:

10.3791/61005

⸱

2020년 6월 7일

 ,  , 
1Department of Anthropology, Indiana University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 에스트로겐 활성에 대한 인간 및 비 인간 영장류 식품을 선별하기위한 기자 분석 β 시판 가능한 에스트로겐 수용체를 최적화했습니다. 우리는 알려진 에스트로겐 성 인간 음식 콩 높은 등록 을 보여 줌으로써이 분석 확인, 다른 식품은 활동을 표시 하지 않는 동안.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물은 많은 동물을위한 음식의 원천이며 수천 개의 화학 물질을 생산할 수 있습니다. 이러한 화합물 중 일부는 내 분 비 기능 등 그들을 소비 하는 척추 동물에 생리 적 과정에 영향을. 가장 잘 연구된 내분비 활성 식물화학 물질인 식물성 물질은 척추동물 내분비 시스템의 시상라모-뇌하수체 골나달 축과 직접 상호 작용합니다. 여기서 우리는 에스트로겐성 생물학적 활성을 갖는 화합물의 존재를 위해 식물 추출물을 선별하기 위해 세포 기반 분석의 새로운 사용을 제시합니다. 이 분석체는 고도의 발현 에스트로겐 수용체 베타 (ERβ)로 설계된 포유류 세포를 사용하고 루시파아제 유전자로 감염되었습니다. 에스트로겐 활성 화합물에 노출 빛을 생산 하는 세포 결과. 이 분석은 생물학적 에스트로겐 성 활동을 테스트하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법입니다. 그것은 일시적인 과도 분석, 특히, 사용의 용이성, 세포의 안정성 및 분석의 감도에 대한 몇 가지 개선이 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물은 생존, 번식, 성장, 발달 및 행동1에중요한 칼로리와 영양소를 제공하는 많은 동물에게 필요한 식량 공급원입니다. 식물은 수천 개의 화학 물질을 생산하며, 많은 화학 물질은 자체 성장, 금식 유지 보수 및 재생을 위한 적응으로 많은 것을 생산합니다. 다른 화합물, 간주 식물 이차 대사 산물 (PSM), 덜 명확한 기능을 가지고, 일부는 독성과 가능성이 약초 및 기생에 대한 방어로 사용하지만 (예를 들어, 알칼로이드, 탄닌)2,3. 이러한 화학 물질 중 일부는 내분비 기능과 같은 동물의 장기 생리 적 과정에 영향을 미칠 수있는 능력을 가지고 있지만, 이러한 내분비 활성 식물화학 물질이 척추 동물 내분비 시스템과 상호 작용하는 이유는 여전히 불분명2,4.

가장 잘 연구된 내분비 활성 식물화학 물질인 식물성 내스트로겐은 구조적으로 나기능적으로 에스트로겐을 모방하여 척추동물 내분비 시스템5의hypothalomo-뇌하수체 고나달 축과 직접 상호 작용하는 폴리페놀식 PSM입니다. 인간 규정식에 있는 식물성 에스트로겐의 섭취는 몇몇 암, 심장병 및 갱년기 현상에 대하여 보호와 연관됩니다, 그밖 효력은 불임 문제를 포함하더라도. 사실, 이러한 화합물의 생리적 효과는 1940년대에 양에서 불임이 식물에스트로겐이 풍부한 클로버(Trifolium지하)에방목된 것으로 인해발견되었습니다. 섭취 할 때, 식물성 에스트로겐은 세포로 전달하고 에스트로겐의 효과를 모방 할 수 있습니다. 식물성 에스트로겐은 양 불임에 부정적인 영향을 주었지만, 식물성 에스트로겐과 생리학 사이의 관계는 간단하지 않습니다. 양처럼, 남부 흰 코뿔소는 대두와 알팔파의 다량에서 파생 된 사료에 에스트로겐 화합물에 감도를 표시합니다. 임신 중이 다이어트를 먹이 여성의 딸은7을재현 할 가능성이 적습니다. 그러나, 다른 연구는 식물성 에스트로겐뿐만 아니라 긍정적 인 효과를 가질 수 있음을 보여 주었다, 이전 마우스에서 난소 여포의 성숙을 포함8,특정 암의 예방, 항산화 활성, 및 항증식 효과9.

식물성 에스트로겐의 효과의 폭은 에스트로겐이 생식 및 중추 신경계의 성장, 발달 및 조절을 포함한 다양한 생물학적 기능에 영향을 미친다는 점을 감안할 때 놀라운 일이 아니다10. 행동의 많은 메커니즘이 있지만, 식물에스트로겐은 종종 수정 하는 능력을 가지고, 강화, 또는 핵 내 에스트로겐 수용 체 알파 와 베타에 대 한 리간드로 작동 하는 그들의 능력을 통해 에스트로겐 신호를 방해 (ERα 및 ERβ). 많은 식물성 에스트로겐은 에스트로겐 수용체를 결합 할 수 있도록 에스트로겐과 유사한 페놀 링 구조를 가지고 있습니다. 에스트로겐과 같은 고뇌에 탄성 적 활성 기능을 가진 사람들은 에스트로겐 반응 요소 (ERE)에 이질하고 결합할 수 있는 활성화된 ER-리간드 복합체를 형성하고 유전자 전사를 유발한다11. 따라서, 에스트로겐과 식물성 에스트로겐은 전사 요인으로 그들의 행동을 통해 세포 활동 및 시스템 기능을 조절합니다.

여기서 우리는 에스트로겐성 생물학적 활성을 갖는 화합물의 존재를 위해 식물 추출물을 선별하기 위해 세포 기반 분석의 새로운 사용을 제시합니다. 이 분석은 ERE프로모터(12)에연결된 반딧불(Photinuspyralis)루시파라제 유전자로 전염된 ERβ를 높게 발현하도록 설계된 중국 햄스터 난소 CHO 세포를 사용한다. 에스트로겐 화합물이 존재할 때, 그들은 ER에 결합, 이질, 그리고 ERE에 결합, 루시 파 제 유전자의 전사로 이어지는. 기판 용액을 추가하면, 루시파라제는 광자 방출로 이어지는 반응을 촉매합니다. 따라서 양수 샘플은 빛을 생성하고 음의 샘플은 생성하지 않습니다.

이러한 시판상 분석은 항성 및 용이성에서 불안정하고 가변적이었던 리포터 유전자 및 에스트로겐수용체(13,14)로포유류 세포를 이식할 실험실의 필요성을 제거한다. 분석법은 식물이 수용체 결합을 통해 에스트로겐 활성을 가지고 있는지 여부를 신속하고 간단하게 결정할 수있는 안정적인 트랜스펙트 플랫폼을 제공합니다.

우리는 콩이 현지 식료품에서 인간의 음식을 사용하여 에스트로겐 이소플라본15의 알려진 농도주어진 다른 모든 식품보다 더 높은 에스트로겐 활성을 가지고 가설을 테스트합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 식물 재료의 준비

  1. 리오필라이저를 사용하여 신선한 수거된 건조 식물 아이템을 동결하십시오.
    1. 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 건조 공정 중에 알루미늄 호일로 챔버를 덮습니다.
    2. 샘플이 완전히 건조하도록 하기 위해 챔버가 더 이상 차갑게 느껴지지 않고 계량시 더 이상 질량을 잃지 않도록 합니다.
    3. 분쇄 될 때까지 빛이없는 멸균 낮은 잔류 물 봉투에 말린 식물을 저장합니다.
  2. 0.85mm 메쉬 스크린을 갖춘 분쇄 공장을 사용하여 샘플을 미세하게 연마합니다.
    1. 추출 될 때까지 빛이없는 가방에 접지 샘플을 저장합니다.

2. 식물 이차 대사 산물 추출

  1. 이차 식물 대사 산물을 추출하려면 HPLC 급 메탄올의 10 mL에 건조 된 샘플 1 g의 비율을 사용합니다.
    1. 분석 균형에 샘플을 무게와 적절한 크기의 Erlenmeyer 플라스크 (125 – 250 mL)에 추가합니다. 그런 다음 메탄올의 적절한 볼륨을 추가합니다. 추출된 샘플의 질량을 기록합니다.
    2. 알루미늄 호일로 식물 메탄올 용액을 덮은 다음 궤도 셰이커에서 3일 동안 실온(RT)에서 100rpm 속도로 회전하여 잠재적으로 에스트로겐 화합물이 메탄올에 용해될 수 있도록 설정합니다.
    3. 필터 용지(125mm)를 사용하여 상체를 드립 여과 시스템에 넣습니다.
    4. 회전 증발기는 시료가 두꺼워질 때까지 식물 추출물을 건조하지만 300mL 의 둥근 바닥 플라스크에 붓습니다. 샘플을 50mL 원형 플라스크에 붓고, 소량의 메탄올로 큰 플라스크를 헹구세요. 메탄올이 완전히 증발 될 때까지 작은 플라스크에서 샘플을 계속 건조시.
    5. 분석 균형을 사용하여 샘플 잔류물을 계량합니다. 잔류물 질량을 기록합니다.
    6. DMSO의 2mL에 0.1 g의 추출물 농도로 디메틸 설산화물(DMSO)에 식물 추출물을 용해한다. 균질화 될 때까지 소용돌이.
    7. 식물 추출물-DMSO 용액을 호박유리 바이알에 4°C에 저장하여 분석할 때까지 보관한다.

주의: 식물은 알려지지 않은 생물학적 활성 화학 물질을 생산할 수 있으며, DMSO는 세포막을 통해 운반할 수 있는 차량입니다. 이러한 샘플을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비와 관리를 사용하십시오.

3. 인간 에스트로겐 수용체 β 트랜스페션 분석12

참고: 무균 기술과 라미나르 플로우 후드는 분석 프로토콜의 1일째에 필요합니다.

  1. 표준 곡선을 위해 17β-Estradiol의 희석을 준비합니다.
    1. 37°C 수조에서 냉동고 저장에서 세포 회수 배지 및 화합물 스크리닝 배지(CSM)를 전송합니다.
    2. 라벨 마이크로 센심 분리기 튜브 중간 1 및 2 (INT1, INT2) 및 1-8.
    3. CSM의 995 μL, CSM의 615 μLINT2, CSM의 900 μL을 가진 튜브 1, 그리고 600 μL의 튜브 2-8로 INT1을 채웁니다. 튜브 8을 따로 설정합니다.
    4. 100 μM 17β-Estradiol 스톡의 5 μL을 INT1로 옮기. 팁을 삭제합니다. 소용돌이.
    5. 각 전송 전에 파이펫을 3번 헹구고 INT1에서 INT2로 10 μL을 전송합니다. 팁을 삭제합니다.
    6. 파이펫을 3번 헹신 다음 INT2에서 100 μL을 튜브 1로 옮킨다. 팁을 폐기합니다. 튜브 1에서 튜브 2로 300 μL을 옮기습니다. 튜브 3에서 7까지 반복하십시오. 튜브 7에서 300 μL을 폐기하여 폐기물 용기에 넣습니다. 튜브 8은 제로이며 에스트라디올을 받지 않습니다. 도금 기준의 최종 농도는 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 및 0 pM estradiol입니다.
  2. 샘플 화합물을 준비합니다.
    1. 소용돌이 샘플.
    2. DMSO의 각 식물 샘플의 4 μL을 취하고 CSM의 496 μL에 추가하여 0.8 % DMSO 솔루션을 생성합니다.
  3. 기자 셀을 급속히 해동합니다.
    1. 37°C 수조에서 세포 회수 배지의 튜브를 회수합니다. 70% 에탄올을 사용하여 외부 표면을 소독합니다.
    2. -80°C 저장에서 리포터 셀을 검색하고 냉동 셀의 튜브로 미리 따뜻워진 CRM의 10mL를 전송하여 해동합니다.
    3. 기자 세포의 튜브를 닫고 5-10 분 동안 37 ° C 수조로 옮습니다.
    4. 수조에서 리포터 셀 서스펜션의 튜브를 검색합니다. 세포의 튜브를 여러 번 부드럽게 반전하여 세포의 응집체를 분해하고 균일한 현탁액을 생성합니다. 70% 에탄올로 튜브 표면을 청소합니다.
  4. 분석 도금
    1. 다중 채널 파이펫을 사용하여 리포터 셀 서스펜션의 100 μL을 각 우물에 분배합니다.
    2. 시료 100μL을 삼중시로 분배하여 적절한 분석 우물에 넣습니다.
    3. 플레이트를 37°C로 옮기고, 22-24h의 가습5%CO2 인큐베이터로 옮김한다.
  5. 2일째를 준비하기 위해 밤새 어두운 냉장고에서 검출 기판 및 검출 버퍼를 해동합니다.
  6. 플레이트 인큐베이션이 끝나기 직전에 냉장고에서 검출 기판 및 검출 버퍼를 제거하고 RT에 평형될 때까지 저조도 영역에 배치합니다. RT에서 한 번, 철저하게 솔루션을 혼합하기 위해 부드럽게 여러 번 각 튜브를 반전.
    1. 인큐베이션이 완료되기 직전에 검출 버퍼의 전체 내용을 검출 기판 튜브에 부어 루시파아제 검출 시약을 만듭니다. 거품을 생산하지 않도록 부드럽게 섞습니다.
    2. 인큐베이션이 완료되면 플레이트를 뒤집어 콘텐츠를 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 깨끗한 흡수성 종이 타월에 접시를 부드럽게 두드려 우물에서 마지막 물방울을 제거합니다.
    3. 각각의 우물에 루시파아제 검출 시약의 100 μL을 추가합니다. 분석 접시를 RT에서 15분 동안 쉬게 하십시오. 접시를 흔들지 마십시오.
  7. 96웰 플레이트 판독 광등계를 사용하여 발광을 정량화합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 식단에서 흔히 발견되는 과일과 채소의 22추출물은 에스트로겐 화합물의 존재를 위해 선별되었습니다. 완두콩 가족은 식물성 식물성 식품16의알려진 공급원뿐만 아니라 무화과, 날짜, 옥수수, 당근, 사과, 바나나, 딸기, 토마토, 케일 및 양배추와 같은 콩류를 포함한 다양한 식품을 분석했습니다. 내분비 방해 화합물은 일반적인 물질 (예를 들어, 플라스틱 및 살충제)에서 발견되며 일부는 ERs17을통해 생물학적으로 활성화됩니다. 가능하면 유기 및 비무기 재배 품목 모두 에스트로겐 활성을 가진 살충제가 결과에 영향을 줄 수 있는 가능성을 설명하기 위해 분석되었습니다.

각 식물 식품 품목은 삼중으로 도금되었고 광미계는 상대 조명 단위 (RLUS)에서 각 우물의 활동을보고했습니다. RLUs의 배경 수준은 표준 8, 제로 농도와 표준 곡선에서 결정되며 참조에 사용됩니다.  곡선의 0점에 대한 RLU 위...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개별적으로 검사하는 의약품 제제에 개발된 ERβ 리포터 분석체는 ERβ를 통해 생물학적으로 활성된 식물성 에스트로겐을 위한 식물성 식품을 선별하는 데도 적합하다. 프로토콜에서 중요한 고려 사항은 식물 샘플을 신중하게 치료하는 것을 포함합니다 : 신선한 식물 재료는 성형 또는 기타 생물학적 저하를 방지하기 위해 신속하게 건조되어야하며 화합물(18)의광분해를 방지하기 위해 빛으로부터 멀리 보관해야합니다. 제조업체에서 제공하는 분석프로토콜(12)은 명확하며 스크리닝 을 위해 거의 수정이 필요합니다. 제조업체가 제안한 표준 곡선은 상부 및 하단 고원을 유지하면서곡선(그림 1)의지수 범위에 속하는 점수를 증가시키기 위해 이 프로토콜에서 수정되었습니다. 정량 분석을 위해이 분석을 사용할 수 있지만, 우리의 목적은 식물을 생물학적 효과, 음식 선택 및 동물을 소비하는 동물의 다른 행동에 높은 활성을 연결...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 영장류 식물 성 식품의 에스트로겐 활동을 결정하기 위해 일시적인 과실 작용 작용의 사용에 초기 교육에 대한 데일 라이트먼에 감사드립니다. 브래드포드 웨스트리치와 C. 에릭 존슨 덕분에 실험실 장비를 설치하고 학생들을 추출 방법으로 교육하는 데 도움을 주었습니다. 마지막으로, 이 연구에 자금을 지원해 주신 인디애나 대학교에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1000 &마이크로; L 피펫
20 µ L 피펫
200 µ L 피펫
37 ° 수조
37 °, 가습 5% CO2 인큐베이터
70% 에탄올
분석 저울
세포 배양 등급 층류 후드
디메틸 설폭사이드
일회용 매체 분지, 멸균
물방울 여과 시스템
삼각 플라스크125 mL 및 250 mL
HPLC 등급 메탄올
인간 ER β Reporter Assay System, 1 x 96-well format assayIndigo BiosciencesIB00411Assay kit - 24개의 시료와 표준
곡선 동결 건조기
다중 채널 피펫
오비탈 쉐이커
플레이트 판독 광도계분석 ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
둥근 바닥 플라스크50 mL 및 300 mL
멸균 마이크로 원심분리기 튜브 또는 멸균 다중 채널 매체 세면대,
멸균 팁200 µ L 및 1000 & 마이크로; L
Whatman 등급 1 종이
소용돌이 팩 가방멸균 폴리에틸렌 가방

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Estrogen Receptor BetaCell based AssayLuciferase ReporterPhytoestrogen ScreeningPlant Extract AnalysisEstrogenic Activity DetectionDMSO ExtractionOrbital Shaker Incubation96 Well PlateLuminometer Detection

관련 논문