hepG2 세포주를 사용하여 입증된 조직 공학을 위한 전기방사 고분자 형태 제어

요약

이 방법은 조직 공학을 위해 다양한 폴리카프로락톤 섬유 형태 및 지형을 테스트할 수 있는 수단을 제공합니다. 크고 작은 섬유는 무작위 방향, 정렬된 방향 및 다공성 극저온 전기 방사 구조로 제작되며 세포 배양을 위한 플랫폼으로 사용됩니다.

초록

전기 방사는 연구원들에게 재현 가능한 마이크로에서 나노 크기의 고분자 섬유를 제작할 수 있는 기회를 제공합니다. 전기 방사 폴리머의 3D 섬유 구조는 세포외 기질(ECM)의 구조적 모방으로 간주됩니다. 따라서 생체 적합성 폴리머로 제작된 전기 방사 섬유는 체외 및 생체 내 조직 성장을 안내하는 인공 ECM으로서의 잠재적 역할에 대해 조직 공학 연구자들에 의해 널리 조사되었습니다. 모든 세포는 기계적 환경에 매우 민감합니다. 이는 세포골격 액틴 필라멘트에 본질적으로 연결된 여러 기계적 전달 경로의 발견에 의해 입증되었습니다. 세포골격(cytoskeleton)은 기질의 강성과 형태에 따라 숙주 세포의 기능과 분화를 지시할 수 있는 기계적 센서 역할을 합니다. 전기방사 섬유는 섬유 크기와 형태 측면에서 모두 조정하여 섬유질 폴리머 스캐폴드 내의 기계적 환경을 쉽게 조절할 수 있습니다. 여기에서는 두 개의 서로 다른 섬유 직경에서 세 가지 서로 다른 형태에 대한 전기 방사 폴리카프로락톤(PCL) 방법이 설명됩니다. 형태학적 섬유 범주는 무작위 배향 섬유, 정렬된 섬유 및 1μm 및 5μm 직경의 다공성 극저온 방사 섬유로 구성됩니다. 이 연구에서 자세히 설명된 방법은 전기 방사 섬유 구조가 조직 생성에 미치는 영향을 조사하기 위한 플랫폼으로 제안됩니다. 이러한 효과를 이해하면 연구원들은 전기 방사 섬유의 기계적 특성을 최적화하고 이 기술의 잠재력을 보다 철저하게 입증할 수 있습니다.

서론

조직 공학 방법은 최근 수십 년 동안 시험관 조직 모델과 생체 내 재생 기술 모두에서 성공적인 조직 재생을 장려하기 위해 세포에 생체 모방 환경을 제공하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법은 일반적으로 세포가 단독으로 또는 가이딩 스캐폴드^(guiding scaffold) 1를 사용하여 3D 응집체를 형성하도록 장려합니다. 스캐폴드는 다공성 또는 섬유질 고분자 나노/미세 구조 또는 수분 흡수성이 높은 하이드로겔 ^2,3,4로 제작할 수 있습니다. 고분자 전기 방사는 천연 세포외 기질(ECM)⁵의 섬유 구조를 모방할 수 있는 짠 나노 마이크로 크기의 고분자 섬유 매트릭스를 생산하는 일반적인 제조 기술입니다. 여러 생체 적합성 폴리머가 전기 방사 공정에 적용 할 수 있습니다. 따라서 전기 방사 섬유는 조직 재생을 촉진하는 인기 있는 매체입니다 ^6,7,8. 전기 방사 섬유는 다양한 조직의 배양에 사용되어 저렴하고 재현 가능한 골격 플랫폼 ^{9,10,11,12,13}에 대한 유망한 방법을 보여줍니다.

세포는 기계적 환경에 대해 예민한 민감성을 가지고 있습니다. 이전 연구에서는 세포 기능, 형태 및 분화에 영향을 미칠 수 있는 메카노트랜스덕션(mechanotransduction)이라고 하는 이 중요한 관계를 강조했습니다^14,15. 진핵생물 세포 골격의 기초는 필라멘트 액틴으로 구성되며 세포 분열, 접착, 이동, 수축 및 형태학에서 중요한 기계적 역할을 합니다. 그것은 세포 외 표면 단백질^{16 , 17 , 18} 과의 연결을 통해 외부 기계적 자극에 의해 조작됩니다 . 줄기세포 분화에 대한 형태학적 영향은 부착 가능한 기질의 모양을 변경함으로써 수많은 연구에서 입증되었으며, 이는 세포 모양을 제어하고 분화 과정을 지시할 수 있습니다^19,20. 더욱이, 세포가 부착하는 기질의 강성은 줄기세포의 운명과 계통에 영향을 미친다^21,22. 줄기세포 외에도 이러한 효과는 다른 계통의 세포에도 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다^23,24. 3차원 조직 공학 방법은 하이드로겔과 섬유소 골격을 모두 사용한 2D 기계 전달 연구에서 발견된 것과 유사한 결과를 보여주었습니다 25,26,27. 또한, 기질 역학은 세포-세포 신호전달^{(cell-cell signalling) 28}을 통해 3D 세포 응집체를 통해 전달됩니다. 재료 역학은 세포 기능을 지시하는 데 중요한 역할을 하므로 조작된 조직을 위한 골격 설계에서 중요한 요소가 되어야 합니다.

이 방법의 목적은 전기방사 폴리카프로락톤(PCL) 섬유 크기 및 형태가 체외 세포 배양에 미치는 영향을 이해하는 것입니다. 이 방법은 신장 조직 공학에 초점을 맞춘 이전 연구에서 채택된^{것이다 9}. 스캐폴드 재구성을 용이하게 하고 모든 세포 유형에 적용할 수 있는 표준화된 방법을 개발하기 위해 보다 자세한 단계별 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 방법으로 6개의 스캐폴드 그룹을 구성했는데, 3개는 큰 5μm 섬유(LG)이고 다른 3개는 서로 다른 PCL 농도를 사용하는 작은 1μm 섬유(SM)입니다. 이러한 LG 및 SM 그룹 내에는 무작위 섬유(RA), 정렬된 섬유(AL) 및 다공성 극저온 섬유(CR)의 세 가지 형태학적 구조가 있습니다. 이러한 골격 그룹은 모두 본질적으로 다른 구조를 가지고 있으므로 세포가 부착되는 고유한 국소 기계적 환경을 제공합니다. 이것이 세포에 전달하는 형태학적 효과를 입증하기 위해 hepG2 세포주를 대표적인 연구로 각 골격 그룹에 파종했습니다. 이 방법은 줄기 세포에서 세포주 및 일차 세포에 이르기까지 모든 세포 유형에 대한 전기 스캐폴드 설계를 위한 기준선 분석으로 제공됩니다.

프로토콜

1. 용액 준비

1. 큰(무작위, 정렬, 극저온) 섬유
   1. 유리 혈청학 피펫을 사용하여 유리 용매 방지 병에 클로로포름 50mL와 메탄올 10mL를 혼합하여 클로로포름과 메탄올을 5:1 비율로 준비합니다.
      주의: 클로로포름과 메탄올은 독성 용매이며 혼합은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   2. 5:1 클로로포름:메탄올에 19 w/v% PCL 용액을 만들려면 PCL 1.9g의 무게를 측정하고 유리 용매 방지 바이알에 5:1 클로로포름:메탄올 10mL에 추가합니다. 파라핀 필름을 사용하여 바이알을 이중 밀봉하고 PCL이 완전히 용해될 수 있도록 바이알을 롤러에 밤새 그대로 둡니다.
      주의 : 혼합은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
2. 작은(무작위 및 정렬된) 섬유
   1. 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)에 7 w/v% PCL 용액을 준비하려면 PCL 0.7g의 무게를 측정하고 유리 용매 바이알에 10mL의 HFIP와 혼합합니다. 파라핀 필름을 사용하여 바이알을 이중 밀봉하고 PCL이 완전히 용해될 수 있도록 롤러에 밤새 그대로 둡니다.
      주의 : HFIP는 독성이 강하므로 배기 후드에서 혼합을 수행해야 합니다.
3. 작은 극저온 섬유
   주의 : 혼합은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   1. 유리 혈청학 피펫을 사용하여 유리 용제 방지 병에 클로로포름 30mL와 메탄올 10mL를 혼합하여 클로로포름과 메탄올을 3:1 비율로 준비합니다.
   2. 3:1 클로로포름:메탄올에 14 w/v% PCL 용액을 만들려면 PCL 1.4g의 무게를 측정하고 유리 용매 방지 바이알에 3:1 클로로포름:메탄올 10mL를 추가합니다. 파라핀 필름을 사용하여 바이알을 이중 밀봉하고 PCL이 완전히 용해될 수 있도록 롤러에 밤새 그대로 둡니다.

2. 전기 방사 설정

알림: 매개변수는 전기 방사 프로세스를 시작하기 전에 설정해야 합니다.

1. 바늘 크기 및 위치
   1. 큰 섬유(무작위, 정렬 및 극저온)의 경우 1mm OD/0.8mm ID 황동 바늘을 사용하고 바늘을 맨드릴 표면에서 230mm 떨어진 곳에 놓습니다.
   2. 작은 섬유의 경우 1mm OD/0.4mm ID 황동 바늘을 사용하고 바늘을 맨드릴 표면에서 15mm 떨어진 곳에 놓습니다.
2. 측면 바늘 움직임
   참고: 그림 1 에 자세히 설명된 비계는 50mm/s의 속도로 100mm 바늘 횡단으로 제작되었으며 프로세스 전반에 걸쳐 좌우로 반복적인 동작이 있습니다.
   1. 측면 모션을 설정하려면 Motion | TNS 1 을 선택하고 시작 위치[mm] 를 -50으로, 거리[mm] 를 100으로, 속도[mm/s] 를 50 으로, 회전 지연[ms] 을 750으로 설정합니다.
3. 주사기 펌프 유량
   1. 대형 파이버(무작위, 정렬 및 극저온)의 경우 사용자 인터페이스에서 재료 탭을 누르고 주사기 펌프를 4mL/h로 설정합니다.
   2. 작은(무작위 및 정렬된) 섬유의 경우 주사기 펌프를 0.8mL/h로 설정합니다.
   3. 작은 극저온 섬유의 경우 주사기 펌프를 2.5mL/h로 설정합니다.
4. 전압 설정
   1. 큰 파이버의 경우 사용자 인터페이스에서 전압 탭을 누르고 양수 및 음수 전압 값을 변경하여 바늘 전압을 +15kV로, 맨드릴 전압을 -4kV로 설정합니다.
   2. 작은(무작위 및 정렬된) 섬유의 경우 바늘 전압을 +17kV로 설정하고 맨드릴 전압을 -4kV로 설정합니다.
   3. 작은 극저온 섬유의 경우 바늘 전압을 +18kV로, 맨드릴 전압을 -4kV로 설정합니다.
5. 맨드릴 회전(큰 섬유와 작은 섬유)
   1. 임의 파이버의 경우 Motion(모션) | 맨드릴 회전 속도를 목표로 하고 250rpm으로 설정합니다.
   2. 정렬된 파이버의 경우 맨드릴 회전 속도를 1,800rpm으로 설정합니다.
   3. 극저온 섬유의 경우 맨드릴 회전 속도를 180rpm으로 설정합니다.

3. 무작위 및 정렬된 섬유(크고 작은 섬유)의 전기 방사

1. 바늘(바늘 크기 및 배치에 대한 정보는 섹션 2.1 참조)을 1mm 구멍 PTFE 튜브에 삽입하고 전기 스피너 바늘 홀더 내에 고정합니다.
2. 흄 후드 아래에서 10mL의 폴리머 용액을 폴리프로필렌 또는 유리(용제성) 주사기에 옮깁니다. 프라이밍하기 전에 주사기를 그대로 두어 기포를 제거하십시오.
3. PTFE 튜브를 통해 주사기를 바늘에 연결하고 주사기 펌프 내에 주사기를 고정합니다. 연결되면 주사기 플런저를 짜고 튜브에 폴리머 용액을 채워 PTFE 튜브를 프라이밍합니다.
4. 맨드릴을 알루미늄 호일로 감싸고 맨드릴 회전 장치에 고정합니다.
5. Mandrel rotation(맨드릴 회전)을 눌러 Motion | 대상 | Rotate and the syringe pump by pressing (재료) | 펌프 1을 시작합니다.
6. 바늘 끝에 작은 폴리머 비드가 형성되면 볼륨을 켜십시오.tage ACTIVATE HIGH VOL을 눌러 VOL. 그런 다음 Taylor cone이라고 하는 폴리머 용액의 원뿔형 돌출부에서 폴리머 제트가 방출되어야 합니다. 맨드릴을 확인하여 맨드릴 표면의 섬유 증착을 확인하십시오.
7. 원하는 양의 PCL 용액이 전기방사될 때까지 전기방사 공정을 실행합니다.
   참고: 그림 1에 제시된 골격의 경우 4mL의 용액을 전기 방사했습니다.
8. 전기 방사가 끝나면 맨드릴에서 섬유로 덮인 알루미늄 호일을 제거하고 과도한 용매 증발을 허용하기 위해 밤새 흄 찬장에 두십시오.
9. 증발 후 섬유를 실온(RT)에서 보관하십시오.

4. 극저온 섬유의 전기 방사

1. 극저온 전기 방사의 경우 극저온 회전 맨드릴을 사용하십시오. 3.1-3.3단계를 반복한 후 다음 단계를 진행합니다.
2. 맨드릴을 알루미늄 호일로 감쌉니다.
3. 맨드릴에 드라이아이스 알갱이를 채웁니다. 극저온 회전 맨드릴 커버를 맨드릴에 고정하여 드라이아이스가 맨드릴에서 빠져나갈 수 없지만 압력은 빠져나갈 수 있도록 합니다. 얼음 결정은 맨드릴 표면에 거의 즉시 형성되어야 합니다.
   주의 : 드라이아이스를 다룰 때는 추위 화상을 방지하기 위해 보호 장갑을 사용하십시오.
4. 맨드릴을 맨드릴 회전 장치에 고정하고 Motion | 대상 | Rotate and the syringe pump by pressing (재료) | 펌프 1을 시작합니다.
5. 바늘 끝에 폴리머 비드가 형성되면 볼륨을 켭니다.tage ACTIVATE HIGH VOL을 눌러 EVOLVE를 누릅니다. 그런 다음 폴리머 용액의 원뿔형 돌출부(즉, 테일러 원뿔)에서 폴리머 제트가 방출되어야 합니다. 맨드릴을 확인하여 맨드릴 표면의 섬유 증착을 확인하십시오.
6. 1시간 동안 전기 회전을 한 후 STOP ALL 을 눌러 프로세스를 일시 중지하고 맨드릴에 드라이 아이스를 채웁니다. 맨드릴을 다시 채우는 동안 솔벤트 증기로부터 적절한 보호를 보장하십시오. 총 3시간 동안 총 4회 동안 이 작업을 수행합니다.
   참고: 4.4 및 4.5 단계를 반복하여 전기 방사를 재개할 수 있습니다.
7. 전기 회전이 끝나면 맨드릴을 조심스럽게 제거하고 즉시 24시간 동안 동결 건조기에 넣어 맨드릴 표면의 얼음 결정을 승화시킵니다.
8. 승화 후 맨드릴에서 섬유로 덮인 호일을 제거하고 부서지지 않도록 주의하면서 RT에 보관하십시오.

5. 비계 펀칭

1. 10-12mm 생검 펀치를 사용하여 섬유 시트에서 골격을 펀칭합니다. 섬유가 알루미늄 호일에 부착된 상태로 남아 있으면 골격을 70% 에탄올에 넣어 쉽게 분리할 수 있습니다.

6. 살균 및 플라즈마 코팅

1. 스캐폴드(웰당 1개의 스캐폴드)를 24 또는 48웰 플레이트에 넣고 3% 에탄올로 70번 세척합니다. 최종 세척에 담근 상태로 두고 -80°C 냉동고에 넣고 얼립니다.
2. 얼면 플레이트를 동결 건조기에 넣고 24시간 동안 동결 건조합니다. 이제 건조된 골격을 플라즈마 코팅할 수 있습니다.
   참고: 플라즈마 코팅기에 접근할 수 없는 경우 인산염 완충 식염수(PBS)에 1% 항생제-항진균제(Anti-Anti)를 넣고 골격을 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 플레이트를 플라즈마 챔버에 넣고 뚜껑을 제거합니다. 플라즈마 코팅기를 500mTorr 및 30초 동안 중간 무선 주파수(RF) 전력으로 실행합니다.
4. 플라즈마 코팅 후 골격을 1mL의 PBS와 1% Anti-Anti-Anti에 담그십시오. 골격은 PBS 용액을 쉽게 흡수해야 합니다.
   참고: 이제 골격에 세포를 파종할 준비가 되었습니다.

7. 세포의 준비 그리고 씨를 뿌리기

참고: 아래에 제공된 기본 세포 배양 기술은 대표적인 결과에서 시연 목적으로 사용된 hepg2 세포를 위한 것입니다. 이러한 원리는 모든 부착 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 세포는 다른 재료와 다른 공정을 필요로 할 수 있습니다. 세포 취급은 무균 기술에 따라 생물 안전 작업대에서 수행해야 합니다.

1. 1 x 10⁶ 냉동 보존된 hepg2 세포를 취하고 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신, 5 mM L-글루타민 및 1% 비필수 아미노산으로 보충된 Eagle의 최소 필수 배지(EMEM)로 구성된 12mL의 완전한 배지가 있는 T75 세포 배양 플라스크에 시드합니다.
2. 세포가 80% confluence가 되면 PBS에서 3x 세척하고 37°C에서 4분 동안 2mL의 트립신을 배양하여 배양 플라스크에서 세포를 분리합니다. 플라스크를 두드린 후 세포가 분리되어야 합니다.
3. 8mL의 완전한 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 120 x g 의 원심분리기에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.
4. 흡인 피펫으로 세포 펠릿 위의 상층액을 제거하고 5mL의 완전한 배지로 교체합니다. 5mL 혈청학적 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
5. trypan blue exclusion 방법을 통해 생성된 세포 현탁액을 계산합니다. 100μL의 세포 현탁액을 1.5mL 바이알에 100μL의 트리판 블루를 추가합니다. 혼합물을 유리 커버슬립 아래의 혈구계에 넣고 현미경으로 세포를 계수합니다.
6. 전체 배지를 추가하거나 제거하여 세포 농도를 2.6 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 배지를 제거하려면 220 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 필요한 배지를 제거한 다음 세포를 재현탁합니다.
7. 웰 플레이트에서 PBS의 1% Anti-Anti를 흡인하고 200μL 피펫을 사용하여 50μL의 2.6 x 10⁶ cells/mL 세포 현탁액을 골격 표면에 시딩합니다.
8. 세포가 37°C 및 5% CO₂ 에서 1-3시간 동안 배양하에서 부착되도록 하여 건조되지 않도록 합니다. 부착이 완료되면 300 μL(48 웰 플레이트의 경우) 또는 500 μL(24 웰 플레이트의 경우)의 배양 배지를 추가하고 37 °C 및 5% CO₂에서 배양합니다.
   참고: 여기서부터 추가 기능 분석까지 표준 세포 배양 기술을 사용할 수 있습니다.

결과

그림 1 은 PCL 용액으로 제작된 작은(~1 μm) 및 큰 섬유(~5 μm)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 보여줍니다. 섬유는 SEM 이미징 전에 스퍼터 코팅기를 사용하여 30초 동안 금-팔라듐(60:40)으로 스퍼터 코팅되었습니다. 대형 섬유는 고점도 PCL 용액을 만들기 위해 클로로포름과 메탄올의 5:1 용액에서 19 w/v%의 높은 농도의 PCL을 사용하여 생산되었습니다. 그런 다음 이 고점도 용액을 높은 유속으로 전기 방사하여 전기장 내에서 큰 고분자 용액 실을 방출했습니다. 따라서 맨드릴에 증착하기 전에 용매의 효과적인 증발을 보장하기 위해 바늘과 맨드릴 사이의 230mm의 큰 거리가 필요했습니다. 반대로, 저점도 PCL 용액을 만들기 위해 HFIP에서 7 w/v% 농도의 낮은 PCL을 사용하여 더 작은 섬유를 생산했습니다. 낮은 유속에서 저점도 PCL 용액을 전기 방사하면 전기장 내에서 바늘에서 더 얇은 실의 PCL 용액이 방출됩니다. 실이 얇을수록 용매가 더 빨리 증발할 수 있었고 바늘은 섬유의 안정적인 증착을 보장하기 위해 70mm에서 맨드릴에 더 가까워야 했습니다. 전기방사하는 작은 극저온 섬유의 경우, 신뢰할 수 있는 프로토콜을 달성하기 위해 PCL 용액을 변경해야 했습니다. 극저온 맨드릴로 전기 방사된 HFIP의 PCL은 반복적으로 섬유 구조가 분해되는 결과를 낳았습니다. 3 : 1 클로로포름 메탄올에서 14 w / v % PCL 농도를 전기 방사하여이 문제를 해결했습니다. 그러나 이로 인해 골격 전체에 걸쳐 섬유 크기가 더 크게 변했습니다. 각 스캐폴드에 대한 섬유 정렬의 정도(섬유 반경 및 방향)는 ImageJ DiameterJ 플러그인⁽²⁹ )을 통해 분석되었으며 그림 2 및 그림 3에 표시되었습니다.

그림 1: 각 스캐폴드 그룹의 형태학적 특성을 보여주는 SEM 이미지. 맨 위 줄에는 작은 섬유가 표시되고 맨 아래 줄에는 큰 섬유가 표시됩니다. 형태학적 그룹은 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 무작위 섬유(random fibers), 정렬된 섬유(aligned fibers) 및 극저온 섬유(cryogenic fiber)로 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 작은 광섬유 세트에 대한 DiameterJ 플러그인의 광섬유 반경(왼쪽) 및 광섬유 방향(오른쪽) 데이터. 형태학은 위에서 아래로 각각 무작위 섬유(random fibers), 정렬된 섬유(aligned fibers) 및 극저온 섬유(cryogenic fiber)로 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 대규모 광섬유 세트에 대한 DiameterJ 플러그인의 섬유 반경(왼쪽) 및 섬유 방향(오른쪽) 데이터. 형태학은 위에서 아래로 각각 무작위 섬유(random fibers), 정렬된 섬유(aligned fibers) 및 극저온 섬유(cryogenic fiber)로 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 방법은 앞서 설명한 방법⁹에 따라 인장 시험기를 사용하여 측정된 6개의 뚜렷하게 다른 인장 특성을 가진 스캐폴드 세트를 제공했습니다. 도표 1 에서 보이는 바와 같이, 거시적인 Youngs의 계수는 큰 맞추어진 섬유에 있는 46.94 ± 3.48 MPa에서 큰 저온 섬유에 있는 0.20 ± 0.01 MPa에 배열합니다. 생리적 조직 강성 값은 100 Pa (신경 조직)에서 2-4 GPa (뼈 조직) ³⁰ 범위입니다. 여기에 보고된 모든 스캐폴드 강성 값이 이 범위 내에 있었습니다.

비 계	변형률%에 대한 영률(MPa)
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
에스엠. 라라	11.14 ± 2.13	9.31 ± 0.43	6.75 ± 0.64	4.75 ± 0.59	3.32 ± 0.40
에스엠. 알	27.94 ± 8.63	28.27 ± 7.36	16.34 ± 4.87	9.10 ± 3.75	5.85 ± 3.11
에스엠. 크롬	0.27 ± 0.11	0.31 ± 0.44	0.31 ± 0.65	0.29 ± 0.59	0.26 ± 0.40
Lg 전자. 라라	9.23 ± 0.78	8.22 ± 0.87	5.96 ± 0.68	3.96 ± 0.59	2.63 ± 0.45
Lg 전자. 알	46.94 ± 3.48	38.03 ± 2.46	27.69 ± 1.22	16.10 ± 1.61	7.87 ± 1.32
Lg 전자. 크롬	0.20 ± 0.01	0.16 ± 0.01	0.12 ± 0.01	0.10 ± 0.01	0.09 ± 0.01

표 1: 2% 변형률 간격의 각 스캐폴드 그룹에 대한 인장 테스트 데이터. 에스엠. RA = 작은 무작위, SM. AL = 작은 정렬, SM. CR = 소형 극저온, LG. RA = 대형 랜덤, LG. AL = 큰 정렬, LG. CR = 대형 극저온. 평균± SD, n = 5로 표시되는 데이터.

그림 4는 세포 형태를 시각화하는 데 사용되는 DAPI 및 팔로이딘 염색을 보여줍니다. 사용된 염색 방법은 문헌^11,12에 확립되어 있습니다. 이미지는 40배 배율 대물렌즈가 있는 현미경(Table of Materials)을 사용하여 획득했습니다. 이미지는 이 방법에 의해 생성된 정렬된 섬유가 hepG2 세포 형태를 연장하고 섬유의 길이를 따라 증식하는 세포를 지시하여 세포 배양 내에서 방향성을 생성했음을 보여줍니다. 대조적으로, 무작위 섬유의 hepG2 세포는 정렬된 구조에서 관찰된 방향성 증식 및 신장을 나타내지 않았습니다. 무작위 구조에서 hepG2 세포는 주변 PCL 섬유에 부착된 확장된 돌출부와 함께 보다 규칙적인 형태를 나타냈습니다.

그림 4: 서로 다른 스캐폴드 형태학에서 DAPI(파란색) 및 팔로이딘(녹색) 염색된 hepG2 세포: 무작위(왼쪽), 정렬(가운데) 및 극저온(오른쪽). 맨 윗줄은 작은 섬유를 보여주고 맨 아래 줄은 큰 섬유를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

다양한 섬유 크기의 생성은 다양한 용매, PCL 농도 및 전기 방사 매개변수의 조합을 사용하여 달성되었습니다. 고분자의 유형, 분자량 및 용매는 생성된 용액의 점도 및 전하 특성에 큰 영향을 미치므로 전기 방사 특성에 큰 영향을 미칩니다⁽³¹). 이 방법에 표시되는 전압은 전기 방사가 수행되는 조건에 따라 변경될 수 있습니다. 온도와 습도는 전기 방사 공정의 거동에 영향을 미칩니다³². 따라서 독자는 모든 장애물에 대응하고 안정적인 테일러 원뿔을 달성하기 위해 전압을 변경할 준비를 하는 것이 좋습니다. 전기 방사 공정에서 배치 간 변동성을 줄이기 위해 환경 제어 인클로저 내에 전기 스피너를 수용하는 것이 좋습니다.

이 방법에서 제시된 다양한 형태를 달성하는 것은 IME 전기 방사 장치의 기능으로 인해 가능합니다. 가변 속도 맨드릴은 광섬유 정렬을 제어하는 데 필수적입니다. 낮은 rpm(<250rpm)에서 맨드릴 회전은 폴리머 제트의 거동으로 인해 무작위 방향의 섬유를 생성합니다. 하전된 폴리머 용액이 바늘에서 방출될 때, 내부 전하와 공기역학적 힘은 맨드릴에 섬유의 혼돈스러운 배열을 놓는 데 사용되는 혼돈의 채찍질 효과를 유발합니다^33,34. 이 휘핑 효과는 맨드릴 회전 속도를 1,800rpm 이상으로 높여 극복할 수 있습니다. 이러한 높은 rpm 맨드릴에 증착된 섬유는 표면 속도가 휘핑 섬유에 의해 나타나는 횡방향 이동에 효과적으로 대응하기에 충분하기 때문에 정렬된 구조를 나타냅니다. 높은 맨드릴 속도를 사용하면 주변 공기를 방해할 수 있으며, 이는 안정적인 테일러 원뿔 생성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

다공성이 높은 극저온 스캐폴드는 -78.5°C에서 맨드릴에 드라이아이스를 채워 생산됩니다. 이것은 맨드릴의 온도를 낮추고 표면의 물방울의 결로 및 동결을 촉진합니다. 형성된 결정은 맨드릴 표면에서 나오는 피크를 나타내고 섬유는 피크 전체에 증착됩니다. 일단 얼음 결정이 승화되면, 섬유의 다공성 구조가 맨드릴^35,36에 남아 있습니다. 결정의 무게와 취약성은 너무 높은 맨드릴 속도(>250rpm)로 인해 과도한 구심력 및 공기역학적 힘으로 인해 결정과 섬유가 맨드릴에서 분리되기 때문에 다공성 정렬 섬유를 생성하는 능력을 제한합니다. 형성된 구조의 취약성으로 인해이 방법으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 맨드릴을 다룰 때와 나중에 비계를 다룰 때도 주의해야 하는데, 액체에서 제거할 때 압착하고 접힐 때 구조가 평평해지기 쉽기 때문입니다. 또한 극저온 맨드릴 없이 성공적으로 전기 스핀하는 용액이 온도 변화와 결정 구조에 의해 치명적으로 파괴될 수 있는 가능성도 있습니다. 극저온 방사(cryo-spinning)할 때 맨드릴 표면에 형성되는 얼음의 양은 습도에 크게 의존하므로 최종 결과에 변동성이 생깁니다. 따라서 전기 방사 공정을 환경 제어 인클로저 내에 포함하는 것이 좋습니다.

이러한 골격에서 세포 성능을 평가하려면 사전에 물질을 멸균해야 합니다. 화학적 방법, 방사선 방법 및 열 기반 방법을 포함하여 고분자를 멸균하는 데 사용할 수 있는 많은 옵션이 있습니다 ^37,38. 각 방법의 효과와 재료의 사용과 재료 자체에 대한 적합성을 평가하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 동결 건조, 플라즈마 처리 및 1% Anti-Anti 용액에 담그기 전에 70% 에탄올에서 살균을 사용합니다. 에탄올을 사용하면 단백질과 미생물이 변성 및 탈수되는 동시에 PCL 물질을 방해하지 않습니다³⁷. 더 강한 용매를 사용하면 PCL이 용해될 수 있습니다. 플라즈마 코팅은 주로 소수성으로 악명 높은 PCL의 친수성을 높이고 세포 부착을 개선하기 위해 이 방법에 통합되었습니다^39,40. 편리하게도 이것은 2차 멸균 단계로도 작동하지만 플라즈마 처리 전후에 골격을 멸균 환경에 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이 방법은 항생제 처리된 배지를 사용한 체외 연구에 적합한 것으로 입증되었습니다. 그러나 in vivo 응용 분야의 경우 에틸렌 옥사이드(EtO) 및 감마 노출과 같은 보다 강력한 옵션을 고려해야 합니다. 멸균이 수행되면 세포를 골격에 파종하고 표준 세포 배양 기술을 적용하여 체외에서 3D 세포 배양을 형성할 수 있습니다.

강성 값은 골격 내에 형성된 다양한 미세 구조에 기인해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 벌크 재료(PCL)는 스캐폴드 사이에서 일정하게 유지됩니다. 따라서 벌크 재료 강성은 그룹 간에 변경되지 않습니다. 극저온 지지체는 섬유 매트릭스 내의 연결성이 감소하기 때문에 다른 그룹보다 훨씬 낮은 강성을 나타내며, 이는 표 1에서 볼 수 있습니다. 감소된 연결성은 섬유상 구조⁴¹ 내에서 신축-우세한 변형과는 대조적으로 더 많은 굽힘-우세한 변형을 유도하는 것으로 생각됩니다. 흥미롭게도, 스캐폴드 강성은 무작위 및 극저온 그룹에서 섬유 크기에 크게 의존하지 않습니다. 그러나, 정렬된 섬유의 세로 강성은 섬유 크기에 대한 의존성이 상당히 높으며, 0-2% 변형률에서 Youngs' Modulus는 작은 섬유의 경우 27.94 ± 8.63 MPa, 큰 섬유의 경우 46.94 ± 3.48 MPa입니다. 인장 시험의 신장 특성으로 인해 이는 세로 단면 내에서 더 높은 벌크 PCL 밀도를 의미합니다. 여기에 제시된 기계적 데이터는 섬유질 아키텍처의 거시적 기계적 스냅샷이라는 점을 반복할 필요가 있습니다. 추가적인 미세기계적 특성화는 세포 규모에 대한 기계적 영향을 완전히 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

이 방법에는 등방성 및 비등방성 형태를 비교하기 위해 무작위 및 정렬된 아키텍처가 모두 포함되었습니다. 광섬유 정렬의 정도는 그림 2의 SEM 이미지와 그림 2 및 그림 3에 제시된 섬유 분석에서 관찰할 수 있습니다. 이방성 특성은 신체의 많은 조직에서 관찰됩니다. 특히, 이것은 근육 및 신경 조직에서 발견되는 것과 같은 정렬된 세포 구조에서 일반적으로 관찰됩니다. 정렬된 고분자 섬유 구조는 이러한 정렬된 구조를 in vitro^42,43에서 재현할 수 있는 기능을 제공합니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 기능은 형태학적 및 기계적 변화에 민감하므로 각 골격 유형의 생물학적 영향을 결정하기 위해 골격에 결합된 세포에 대해 추가 기능 분석을 수행해야 합니다.

기존의 다른 비계 제작 기술과 비교하여 이 방법은 기계적 특성과 형태를 비교적 많이 제어할 수 있는 마이크로 스캐폴드 구조를 생산하는 간단한 방법을 제공합니다. 상 분리, 염 침출 및 가스 발포와 같은 대체 PCL 스캐폴드 제작은 공극 공간 및 기공 크기 측면에서 형태학적 제어를 가능하게 합니다. 그러나 기공 및 구조 형상은 대체로 동일하게^{유지됩니다} 44,45,46,47. 따라서 등방성 수준과 같은 품질은 전기 방사와 비교하여 쉽게 변경할 수 없습니다. 스캐폴드 생산에 널리 사용되는 하이드로겔 물질은 가교 결합된 고분자 사슬(⁴⁸)의 수준을 변경함으로써 고분자 기질의 강성을 변경하는 수단을 제공합니다. 또한 다양한 방법을 통해 3D 프린팅이 가능하여 형태학⁴⁹에 대한 탁월한 제어를 제공합니다. 그러나 생체 적합성 하이드로겔 재료에서 전기방사 스케일 분리능을 달성하는 것은 실질적으로 구현해야 하는 과제로 남아 있습니다^50,51. 전기 방사 골격은 지난 10년 동안 조직 공학 연구에서 일반적으로 등장해 왔으며, 다양한 세포 유형을 가진 새로운 재료 및 응용 분야의 도입이 항상 모색되고 있습니다. 전기방사 스캐폴드를 위해 새로운 재료가 지속적으로 개발되고 있지만, 기존 전기방사 재료 및 방법에 대한 추가적인 생물학적 특성화의 기회는 여전히 남아 있습니다. 설명된 방법은 기본 세포 배양 기술에 직접 적용할 수 있기 때문에 시험관 내 생물학적 연구를 용이하게 하기 위한 방법으로 제안됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10mm 생검 펀치	Acuderm	P1025
15mL Falcon tube	Thermo-scientific	339650
20mL 유리 바이알	Fisherbrand	11513542
48웰 세포 배양 플레이트	Greiner Bio-one	677180
Anti-Anti 100X	Gibco	15240062
클로로포름	Acros Organics
DAPI	시그마-알드리치	D9542
독수리 최소 필수 매체	Gibco	11090081
Electrospinner	IME Technologies	EC-DIG
태아 소 혈청	GE 헬스케어	SH30071.03
골드-팔라듐 스퍼터 코팅기	Emscope	SC500A
HepG2 세포 라인	: 시그마-알드리치	, 85011430
헥사플루오로이소프로판올(HFIP),	맨체스터 오가닉스,	G26383
L-글루타민, 200mM,	Gibco	25030081
MEM 비필수 아미노산,	Gibco	11140050
메탄올	아크로스 오가닉스	11984591
페니실린-스트렙토마이신, 10,000 U/mL	Gibco
Phalloidin	Abcam	ab176754
인산염 완충 식염수(PBS)	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
플라즈마 코팅기	Harrick Plasma	PDC-002
폴리카프로락톤(평균 MW 80,000)	Sigma-aldrich	440744
PTFE 주사기	Fisherbrand	12941031
주사 전자 현미경	Hitachi	S4700
T75 배양 플라스크	코닝	CLS430641
트리판 블루(0.4%)	Gibco	15250061