방법 논문

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

DOI:

10.3791/61050

⸱

2020년 11월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

초록

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다발성 경화증 (MS)은 환경 적 요인과 취약한 유전 배경의 조합으로 인한 중추 신경계 (CNS)의 자가 면역 질환입니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 MYelin 항원특이적 T 림프구가 CNS에서 염증 반응을 개시하는 병원발생을 조사하는 데 널리 사용되는 MS의 전형적인 질병 모델이다. CNS의 림프구가 질병의 발달을 어떻게 조절하는지 평가하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS에서 침투된 림프구의 양과 품질을 측정하는 접근법은 뇌에서 침투된 림프구를 분리하고 검출하는 데 어려움이 있기 때문에 매우 제한적이다. 이 원고는 CNS에서 침투된 림프구의 격리, 식별 및 특성화에 유용하며 림프구가 CNS 자가 면역 질환의 개발에 어떻게 관여하는지에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다.

서론

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CNS의 만성 탈근질환으로서 MS는 전 세계적으로 약 250만 명에게 영향을 미치고 치료 치료1이부족하다. 또한 골수린 항원 특이적 T 림프구가 염증 반응을 시작하고 CNS2에서탈량 및 축산 손상을 유도하는 자가 면역 질환으로 간주됩니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 CNS3에서고전적인 자가면역 탈생 질환 모델로서 MS의 병원성 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용되고 있다. EAE를 유도하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 하나는 골린 성분으로 동물을 예방 접종함으로써 EAE를 적극적으로 유도하는 것입니다, 또 다른 하나는 뇌성 T 세포를 수용체2,,4,,5로이송하여 입양 전달이다. EAE에 대한 감수성은 다른 동물 균주6에서다릅니다. C57BL/6 마우스에서, myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 35-55 도전은 유전자 표적 마우스를 가진 실험에서 빈번하게 이용되는 CNS에 있는 광대한 탈근 및 염증을 가진 단면질환을 유도합니다7.

골린 특이적 반응성 T 세포의 생성은 EAE에서 질병의 발생 및 발달에 필요하며 EAE와 MS. 활성화 된 자동 반응성 T 림프구가 건강한 CNS로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하고 EAE 질병을 개시하는 면역 징후입니다. MOG 35-55 Ag가 발생하면, 이러한 T 림프구는 염증과 이펙터 세포의 모집을 CNS로 유도하여 탈근및 축축 파괴8,,9의결과이다. EAE 모델에서는 신경항원 특이적CD4+ T 세포가 신경염증 및 병리학3,,10을시작하고 유지할 수 있다는 충분한 증거가 있다. 생산된 주요 사이토카인에 따라 CD4+ T 림프구는 다른 하위 집합으로 분류되었습니다: Th1 (인터페론 γ 생산 특징), Th2 (인터류킨 4의 생산 특징), Th17 (인터류킨 17의 생산에 의해 특징). Th1 과 Th17 세포의 활성화는 대식세포 활성화 및 염증 부위에 호중구를 모집할 수 있는 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17을 분비함으로써 EAE 및 MS의 염증성 탈생의 유도,11유지 및 조절에 기여하는 것으로 여겨진다.

자동 반응성 T 세포가 CBB를 CNS로 교차하고 MS 및 EAE에서 질병의 발달을 유도하기 때문에 CNS에서 T 세포를 분석하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS12로부터림프구의 분리를 위한 확립된 프로토콜은 거의 없다. 따라서, 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 마커 CD45, CD3, CD4, INF-g 및 IL-17을 사용하여 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 T 림프구를 분석하는 데 최적화된 방법이 개발되었다. 이 방법은 MOG35-55 보조 균 결핵 H37 라와 백혈구 독소 작업 용액 (PTX)을 사용하여 마우스에서 EAE의 활성 예방 접종 모델을 유도합니다. 이어서, 기계적 분리 및 밀도 그라데이션 원심분리 방법은 CNS 단핵세포의 분리를 위해 사용된다. 마지막으로, 최적화된 유동 세포측정 게이팅 전략은 여러 마커를 염색하여 뇌에서 T 림프구와 하위 집합을 식별하는 데 사용됩니다.

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프로토콜

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여기에 설명된 모든 방법은 상하이 자오퉁 대학교 기초의학대학의 동물위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 재료의 준비

  1. MOG35-55의 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 서열을 사용하여 상업적 인 공급원으로부터 리오필화 펩티드를 얻습니다. 펩티드의 순도가 >95%인지 확인합니다. 인산염 완충식식염(PBS)에 10 mg/mL MOG 스톡 용액을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
  2. M. 결핵 H37 Ra의 4 mg/mL 스톡 솔루션을 완전 프룬트(CFA)의 25mL에 M. 결핵 H37 Ra 100 mg 튜브를 넣고 믹싱을 준비합니다. 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오.
  3. PBS의 50mL에 PTX의 50 μg를 추가하여 1 ng/μL 백합 소독 작업 솔루션(PTX)을 준비하십시오. 작업 용액을 -20°C에 저장합니다.
  4. 모든 항체(즉, FITC 항마우스 CD3, PE/Cy7 항마우스 CD4, PerCP/Cy5.5 항마우스 CD11b, 알렉사 플루오르700 항마우스 CD45.2, PE 항마우스 IL-17A 및 APC 항마우스 IFN-γ)를 저장합니다.
  5. PBS의 500mL에 2mM 에틸렌 디아민 테트라아세틱산(EDTA)과 1% 태아 소 혈청(FBS)을 추가하여 유동 세포체 염색(FCS) 버퍼를 만드십시오.

2. C57BL/6 마우스의 하우징

  1. 8-12주에 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오.
  2. C57BL/6J 마우스를 주입하기 7일 전에 적어도 반케.
  3. 12h 빛/암흑 주기에서 일정한 온도와 습도에서 병원체가 없는 조건하에서 동물 시설에 마우스를 보관하고 물과 표준 펠릿 식품에 무료로 접근할 수 있습니다.

3. C57BL/6 마우스의 예방 접종

  1. 모든 스톡 솔루션을 실온(RT)에서 15분 동안 그대로 두어 완전한 재수화를 보장합니다.
  2. 3 mg /mL 작업 용액을 준비하기 위해 PBS70μL로 MOG 펩티드 스톡 용액 300 μL을 희석하십시오.
  3. M. 결핵 H37 Ra 스톡 용액 1mL과 MOG35-55 펩타이드 작동 용액을 별도의 10mL 주사기에 넣은 다음 4방향 스톱 콕을 사용하여 최소 10분 동안 유화합니다. 주입 전에 완전한 유화를 보장합니다.
  4. 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)의 관전 주사와 EAE의 절정에 마우스를 마취.
  5. 1mL 주사기를 사용하면 목 근처의 뒤쪽에 있는 두 부위에 MOG 35-55/CFA 에멀젼(300 μg/200 μL)의 100 μL을 가진 마우스를 피하시 주사합니다. PBS의 200 μL을 가진 피하 로 제어 마우스를 피하.
  6. 같은 날(0일)과 2일째 예방접종(PI)에 1 ng/μL PTX 작업 용액의 200μL을 가진 마우스를 내분한다. PBS의 200 μL을 가진 관면 마우스를 내성으로 주입합니다.
  7. 온난 패드와 함께 자신의 홈 케이지에 마우스를 전송합니다.
  8. 표 111,,13에표시된 신경 학적 징후를 맹목적으로 Table 1주사 후 매일 모든 마우스를 검사하고 채점한다. 점수가 4 학년보다 더 나쁜 경우 동물을 안락사.
  9. 질병 과정 동안 체중 변화를 기록합니다. 이는 EAE모델(11)및13에서의질병 활성에 대한 귀중한 추가 척도이다.
  10. 개별 마우스에 대한 임상 징후의 첫 날을 추가하고 그룹에서 마우스의 수로 분할; 결과가 시작됩니다. 개별 마우스에 대한 최대 EAE 점수의 첫 날을 추가하고 그룹에서 마우스의 수로 분할; 결과가 최고입니다.

4. 뇌에서 단세포 서스펜션 준비

  1. 15mL 원물 튜브에서 PBS를 사용하여 9:1 비율로 밀도 그라데이션 배지를 희석하여 최종 100% 용액을 산출합니다.
  2. 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)의 관전 주사와 EAE의 절정에 마우스를 마취하고 멸균 얼음 감기 PBS의 20 mL와 내막 내 perfuse. 20mL 주사기를 사용하여 심장의 왼쪽 심실에 PBS를 천천히 꾸준히 주입하고 오른쪽 아트리움을 열어 이를 달성하십시오.
  3. 코에서 목까지 두개골을 조심스럽게 자른 다음 두개골 상자에서 뇌를 50 mL 원문 튜브에서 RPMI10 mL로 제거합니다. 잘 섞어서 참혈세포를 제거합니다. 그런 다음 포부로 매체를 제거하고 RPMI10 mL을 추가합니다.
  4. 뇌와 중간을 100mm 접시에 놓습니다. 면도날로 잘게 자릅니다.
  5. 접시에서 깨끗한 파이펫으로 얼음처럼 차가운 7mL 소결 유리 균질화로 6mL를 옮긴다. 파이펫에 많은 양의 조직을 두지 마십시오. 소량은 피할 수 없습니다.
  6. 먼저 유봉의 "느슨한"플런저를 사용하여 뇌를 갈아, 다음 서스펜션이 균일 할 때까지 "꽉"플런저를 사용하고, 미리 냉각 된 15 mL 원추형 튜브에 부어 얼음에 유지.
  7. 모든 샘플이 균질화된 후 볼륨을 추정합니다. RPMI로 볼륨을 7mL로 조정합니다. 그런 다음 차가운 15mL 원심분리기 튜브에 얼음-차가운 100% 지하 멤브레인 매트릭스 3mL을 넣고 최종 30% 밀도 그라데이션 배지를 산출하기 위해 뇌 의 7mL을 첨가한다. 반전으로 몇 번 섞으세요. 소용돌이하지 마십시오.
  8. 선명한 인터페이스를 보장하기 위해 3mL 파이펫으로 RPMI에 70% 언더레이 밀도 그라데이션 배지의 1mL을 신중하고 천천히 추가합니다.
  9. 원심분리기 800 x g에서 4°C에서 20분 만드실 수 있습니다. 가속을 1로 설정하고 감속을 0으로 설정합니다. 원심 분리 후, 거의 모든 상부 단계를 흡인하고, 상단의 골린을 완전히 제거하는주의(도 1).
  10. 새로운 15원심분리기 튜브로 인터페이스를 제거합니다. RPMI로 볼륨을 10mL로 조정합니다.
  11. 원심 분리기 500 x g에서 10 분 동안. 원심 분리 후, 상퍼를 흡인. 펠릿을 ~200μL의 유동 세포피성 스테인딩(FSC) 버퍼로 재연한다. 그런 다음 펠릿은 FACS에 얼룩이 될 준비가 되어 있습니다.

5. 뇌에서 단일 세포의 흐름 세포 측정 분석

  1. 세포를 계산하기 위하여 혈전계 및 현미경을 사용합니다. 세포의 10 μL을 트라이판 블루10 μL에 넣고 잘 섞은 다음 혈류계에 10 μL을 배치하여 셀을 계산합니다. 그런 다음 반전된 현미경(예: 올림푸스 반전 현미경)에서 마이크로리터당 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
  2. Aliquot 약 2 x 106 6 RPMI에 있는 세포의 단일 우물으로 96 웰 플레이트.
  3. 500x 세포 자극 칵테일과 단백질 수송 억제제를 우물에 추가합니다.
  4. 인큐베이터에서 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 배양한다.
  5. RT에서 5 분 동안 400 x g의 세포를 원심 분리하고 FCS 버퍼의 100 μL에서 셀을 다시 중단하십시오.
  6. 비특이적 Fc 중재 상호 작용을 차단하기 위해 염색하기 전에 4°C에서 10분 동안 항마우스 CD16/CD32 Fc 블록(1:33)으로 세포를 미리 배양한다.
  7. 세탁하지 않고 얼룩 세포 표면 마커. 항마우스 CD45.2(1:200), 항마우스 CD11b(1:200), 항마우스 CD3(1:200), 항마우스 CD4(1:200) 항체를 추가한다.
    참고: 양수 및 음의 문을 결정하기 위해 각 색상에 대해 형광이 하나(FMO)를 뺀 값과 동형 조절 항체를 염색해야 합니다.
  8. 4°C 또는 얼음에서 적어도 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  9. FCS 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다. 마이크로티터 플레이트에 200 μL/웰을 사용하십시오. RT에서 5 분 동안 400 x g의 원심 분리기는 상체를 폐기하십시오.
  10. 세포를 고정하기 위해 각 웰에 세포 내(IC) 고정 버퍼200 μL을 추가합니다. 용액에서 셀이 완전히 다시 중단되었는지 확인합니다.
  11. RT에서 30-60 분 동안 배양하십시오.
  12. 원심 분리는 5 분 동안 RT에서 400 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
  13. 각 웰에 1배 투과화 버퍼200 μL을 추가하고 5분 동안 RT에서 400 x g의 샘플을 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
  14. 잔류 부피로 펠릿을 다시 중단하고 1배 의 투과화 버퍼로 약 100 μL로 볼륨을 조절합니다.
  15. 세포 내 항원 검출을 위해 항마우스 IL-17A(1:200) 및 항마우스 IFN-g(1:200) 항체를 첨가한다.
  16. 4°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  17. 각 웰에 1x permeabilization 버퍼의 100 μL을 추가하고 5 분 동안 RT에서 400 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
  18. 스테인드 셀을 100μL의 유동 세포분석 염색 버퍼로 재보종한다.
  19. 유동 세포측정에 의해 분석합니다.
    참고: 유량 사이토미터의 레이저 및 보상 설정이 조정되고, 샘플은 사이토미터에 배치되며, 모든 이벤트는 제조업체의 권장 사항에 따라 기록됩니다.

6. 데이터 분석

  1. FSC-A 대 FSC-H 및 SSC-A 대 SSC-H를 사용하는 게이트 싱글트.
  2. 크기에 따라 FSC-A 및 SSC-A를 사용하여 게이트 라이브 셀.
  3. 다음으로, 단핵구를 제외한 백혈구를 CD45+ CD11b- 세포에- 게이팅하여 식별한다.
  4. 그런 다음 CD3+CD4+ 세포에서 게이팅하여 CD4 T 림프구를 식별합니다.
  5. 마지막으로, IFN-γ+ 세포 및 IL-17+ 세포에 별도로 게이팅하여 Th1 및 Th17 하위 집합을 식별하고, 동형 대조군 및 FMO를 사용하여 양성 및 음수 집단을 결정한다.

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결과

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C57BL/6 마우스의 예방 접종 후, 모든 마우스는 신경 징후를 위해 매일 계량, 검사 및 등급이 매겨졌습니다. EAE의 대표적인 임상 과정은 도 2B에제시된 바와 같이 도 2A에 제시된 질병 곡선과 마우스내 체중의 변화를 초래한다. MOG35-55로 예방접종된 C57BL/6 마우스는 보통 10~12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작했고, 활성 예방접종 후 15~21일 경에 질병의 피크를 달성하였다(그림2A). 체중 변화는 EAE 모델에서 귀중한 지표였습니다. 질병의 개시 의 앞에, 면역한 마우스의 체중은 점차적으로 증가한 다음, 전형적으로 증가하는 질병 현상에 상관관계를 감소시켰습니다. EAE의 절정에, 마우스는 또한 가장 낮은 체중을 보였다(그림 2B). 그런 다음 임상 증상이 감소함에 따라 체중이 약간 회복되었...

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토론

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본 연구는 C57BL/6 마우스에서 MOG35-55를 사용하여 EAE를 유도하고 모니터링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 EAE MS의 전형적인 신경면역 실험 동물 모델로 간주되는 것으로 간주되어 연구의 목적에 따라 유도에 사용되는 마우스 균주 또는 단백질의 종류를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, SJL 마우스에서 PLP139-151 펩티드를 사용하면 재발에 대한 치료 효과를 평가하기에 특히 적합한 재발-방출 EAE 질병 과정을 유도할 수있다. 여기에 설명된 실험 절차는 다른 EAE 프로토콜7에도적용할 수 있습니다. 이 모델에서, C57BL/6 마우스는 MOG35-55 펩티드로 면역화되고 단면질환을 개발한다. 5점 득점 시스템은 EAE의 심각도를 평가하는 데 사용됩니다. 0-3점 또는 0-10점에 이르는 여러 득점 시스템이 질병 심각도7,,16,

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(31570921 ~ZJ, 81571533 ~ LS), 상하이 시 보건위원회 및 가족 계획 (201540206 ~ ZJ), 루이진 병원 노스 연구 보조금 (2017ZX01 )

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor700 안티 마우스 CD45.2eBioscience56-0454-82
안티 마우스 CD16/CD32 Fc 블록BioLegend101302
APC 안티 마우스 IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce 균질화 휘튼353107542
eBioscience 세포 자극 칵테일 (단백질 수송 억제제 포함) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience 세포 내 고정 및 투과화 완충액 세트eBioscience88-8824-00
FITC 안티-마우스 CD3BioLegend100203
FITC 랫 IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anti-mouse IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 안티-마우스 CD4BioLegend100422
PE/Cy7 쥐 IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 안티-마우스 CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400631
백일해 독소 (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Rat MOG35– 55 펩타이드Biosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

참고문헌

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  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44(2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881(2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
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  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249(2019).

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MOG 35 55C57BL 6

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