Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
수소-황량제 교환 질량 분석법(HDX-MS)은 효소 형태 변화와 효소 기질 상호작용의 생체물리학적 특성화를 위한 강력한 방법입니다. HDX-MS는 소량의 물질만 소비하며, 효소/기질 라벨링 없이 근동 조건하에서 수행할 수 있으며, 큰 효소 및 다단백 복합체에서도 효소 형성 역학에 대한 공간적으로 해결된 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법은D2O에서 제조된 완충제로 관심 있는 효소의 희석에 의해 개시된다. 이것은 중수소 (N-D)를 가진 펩티드 본드 아마이네스 (N-H)에서 프로티움의 교환을 트리거합니다. 원하는 교환 시점에서, 반응 알리쿼트가 담금질되고, 효소는 펩티드로 프로테오리제화되고, 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의해 분리되고, 각 펩타이드의 질량의 변화(중수소용 수소의 교환로 인해)는 MS에 의해 기록된다. 각 펩티드에 의한 중수소 섭취량의 양은 해당 펩티드의 국소 수소 결합 환경에 크게 의존한다. 펩타이드는 효소 교환 중음류의 매우 역동적인 부위에 매우 빠르게 존재하는 반면, 잘 정렬된 지역에서 유래된 펩타이드는 훨씬 더 느리게 교환을 받는다. 이러한 방식으로, HDX 속도 로컬 효소 형성 역학에 대 한 보고서. 다른 리간드가 있는 중수소 섭취량 수준에 대한 혼란은 리간드 결합 부위를 매핑하고, 알로스터 네트워크를 식별하고, 효소 기능에서 형성 역학의 역할을 이해하는 데 사용될 수 있다. 여기에서, 우리는 우리가 더 나은 lanthipeptides에게 불린 펩티드 천연 제품의 모형의 생합성을 이해하기 위하여 HDX-MS를 이용한 방법을 보여줍니다. Lanthipeptides는 전통적인 구조 생물학 접근으로 공부하기 어려운 크고 다기능, 형태역학적 효소에 의해 번역 후 변형되는 유전자 로코딩된 펩티드입니다. HDX-MS는 이러한 유형의 효소의 기계적인 특성을 조사하기 위한 이상적이고 적응력이 뛰어난 플랫폼을 제공합니다.
서론
단백질은 펨토초 규모의 결합 진동에서부터 여러 초 동안 발생할 수 있는 전체 단백질 도메인의 재배열에 이르기까지 시간 척도에 따라 다른 적합성을 샘플링하는 구조적으로 역동적인분자입니다. 이러한 형태 적 변동은 종종 효소 / 단백질 기능의 중요한 측면입니다. 예를 들어, 리간드 결합에 의해 유도된 형태 변화는 촉매에 필요한 활성 부위 잔류물을 구성하거나, 순차적 운동 메커니즘에서 기판 결합 부위를 정의하거나, 환경에서 반응성 중간체를 차폐하거나, 알로스티아 네트워크를 통해 효소 기능을 조절함으로써 효소 기능을 조절하는 데 매우 중요합니다. 최근 연구에 따르면 형태 역학은 진화 전반에 걸쳐 보존될 수 있으며 분자 운동을 보존하는 혼란은 기판 특이성의 변화와 새로운 효소 기능2,3의출현과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었다.
최근 몇 년 동안 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX-MS)은 단백질 형성 경관이 리간드 결합 또는 돌연변이 발생4,5,6,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 중음 시약 및 효소 스톡 솔루션 준비
- D2O(99.9% 원자 분수 D)의 100-200x 농축 재고 솔루션으로 HDX 반응(완충제, 염, 기판, 리간드 등 포함)에 필요한 시약을 준비합니다. 버퍼 스톡 솔루션의 최소 50mL를 준비합니다.
참고: HalM2의 특성화를 위해 500m MgCl2,100mM tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 (TCEP), 750 mM ATP (HEPES 버퍼), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2, 500 mMM MMM MP2 및 50mMMMMMMMMMP를 준비했습니다. - 건조에 대한 재고 솔루션을 동결하고 lyophilize합니다.
- D2O에서재용해, 가능한 한 교환 가능한 양성자를 가능한 한 많이 교체하기 위해 적어도 하나의 추가 시간을 반복한다.
- 유의한 HEPES 버퍼 스톡의 pD를 농축 된 NaOD / DCl로 원하는 값으로 조정하여 다음 관계(27)를염두에 두고 :
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
각 샘플 주사 세트에 대한 보철 소화의 품질과 워크플로우의 재현성을 평가할 필요가 있습니다. 따라서, HDX-MS 애사를 수행하기 전에, 관심 있는 단백질의 프로테오리시스에 대한 효과적인 조건을 확립하고, 역상 액체 크로마토그래피 및 가스상 이온 이동성을 이용한 펩티드의 분리를 위해, MS를 이용한 펩타이드검출을 위한 것이 필수적이다. 이를 위해 관심 있는 단백질에 대한 기준 샘플(중수소부재시 채취)을 먼저 조사해야 한다(섹션 3). 도 3A−C의 크로마토그래피 데이터는 HalM2 lanthipeptide synthetase의 3개의 기준 샘플에 대한 총 이온 크로마토그램(TiCs)을 보여줍니다. TIC는 질량 스펙트럼 검사에 포함된 모든 m/z 값에서 모든 이온 카운트의 합계에 따라 시간 종속변경입니다. 3분에서8분 사이의 TiC의 더 자세히 보기는 그림 3D−F에
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에 제시된 HDX-MS 워크플로우는 단백질의 구조적으로 역동적인 요소의 공간 분포를 매핑하고 이러한 역학이 변투(리간드 결합, 효소 돌연변이 발생 등)에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지 조사하기 위한 매우 견고한 플랫폼을 제공합니다. HDX-MS는 일반적으로 형성 역학을 조사하는 데 사용되는 다른 구조 생물학 접근 방식에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 보유하고 있습니다. 특히 소량의 단백질만 필요합니다. 본 명세서에 기재된 워크플로우를 사용하여, 1 μM 단백질의 1mL 샘플은 5개의 교환 시간 점을 포함하는 각각의 삼중 화질 HDX 반응에 충분한 물질을 제공한다. 더욱이, 관심있는 단백질에 대한 크기 제한은 거의 없으며, 단백질 복합체는 HDX-MS 접근법에 동등하게 순종한다. 크기 제한은 펩틱 펩티드가 크로마토그래피로 해결할 수 있는 범위와 m/z 및 이온 이동성 치수에 의해서만 제한됩니다. 따라서 많은 단백질/단백질 복합체의 경우 HDX-MS는 단백질-단백질 상호 작용 인터페이스, 리간 드니스트 사이트, 형태 역학.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
우리는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 퐁드 드 레체슈 뒤 퀘벡 자연 에 테크놀로지, 혁신을위한 캐나다 재단, 맥길 대학 창업 기금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k 원심 여과 장치(Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| 포름산 | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| 염화마그네슘 | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| 염화 | 칼륨BioBasic | PB0440 | |
| 인산칼륨 | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | 펩타이드는 요청에 따라 합성되었습니다 |
| 재료/장비 이름 | Company | 카탈로그 번호< | strong>Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | 버전 1.08 | |
| DynamX | Waters | 버전 3.0 | |
| MassLynx | Waters | 버전 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | 버전 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrö dinger | 버전 2.2.2 | |
| 재료/장비 이름 | Company | 카탈로그 번호 | Comments/Description |
| Instrument and Equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 분석 컬럼 | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX 시스템 | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| 마이크로팁 pH 전극 | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH 컬럼 또는 Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | 워터스 |
참고문헌
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Bi....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
