이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근

4.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

2020년 6월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

마이크로 버블 에이전트를 가진 집중한 초음파는 혈액 두뇌 장벽을 초점하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술은 혈액 뇌 장벽을 통해 에이전트의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용되었습니다. 이 문서에서는 MRI 지침유무이드 없이 설치류 뇌에 국소화된 전달을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

스테레오탁스 수술은 설치류 뇌에 국소화된 약물 및 유전자 전달을 위한 금본위제입니다. 이 기술은 대상 뇌 영역에 정확한 국소화및 대상 부작용의 감소를 포함하여 전신 전달에 비해 많은 장점이 있습니다. 그러나, 스테레오 탁스 수술은 그것의 번역 효능을 제한 하는 매우 침략, 긴 복구 시간을 필요, 여러 뇌 영역을 대상으로 할 때 도전을 제공. 집중 초음파(FUS)는 순환 마이크로버블과 함께 밀리미터 크기의 영역에서 혈액 뇌 장벽(BBB)을 일시적으로 개방하는 데 사용될 수 있다. 이를 통해 일반적으로 BBB를 교차할 수 없는 체계적으로 전달된 에이전트의 원두개 내 지역화를 가능하게 합니다. 이 기술은 스테레오 탁스 수술에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 그러나 현재까지이 기술은 장비 및 표준화 된 방법에 대한 제한된 접근으로 인해 신경 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 저렴하고 재현 가능하므로 모든 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 FUS BBB 개방 (BBBO)에 벤치 탑 접근 방식을 제공하는 것입니다.

서론

기본적인 신경과학에서 많은 발견에도 불구하고, 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료의 수는 상대적으로 제한된남아1,2. 신경 장애에 관여하는 유전자, 분자 및 세포 회로에 대한 깊은 이해는 현재 기술3을가진 인간에서 실현 할 수없는 유망한 치료법을 제안했습니다. 효과적인 치료는 종종 뇌 침투 및 사이트 별4,5,6,7,8의필요성에 의해 제한됩니다. 그러나, 특정 뇌 부위에 국소화된 약물 전달의 기존 방법(예를 들어, 주사 또는 캐뉼라를 통한 전달)은 침습적이며 두개골9에서개구부를 필요로 한다. 이 수술의 침습성은 인간의 뇌에 국소 전달의 일상적인 사용을 방지. 또한, 조직 손상 및 그 결과 염증 반응은 유비쿼터스 상반신 주사에 의존하는 기본 및 전임상 연구를 위해 혼동된다10. 비침습적으로 혈액 뇌 장벽에 걸쳐 에이전트를 제공 하는 기능 (BBB) 특정 뇌 영역에 그들을 대상으로 신경 장애에 대 한 치료에 엄청난 영향을 미칠 수 있습니다., 동시에 전임상 연구에 대 한 강력한 조사 도구를 제공 하는 동안.

최소한의 조직 손상을 가진 BBB를 가로지르는 표적 수송의 한 가지 방법은 마이크로버블과 함께 경두개 중형 초음파(FUS)로BBB11,12,13,14,15,16을집중적으로 열고 일시적으로 개방한다. FUS BBB 개구부는 신경영양인자17,18,19,유전자 치료20,21,22,항체23,신경전달물질24,나노입자25,26,27, 28,28, 29등뇌 영역을 대상으로 치료제를 국소화하여 신경퇴행성 질환, 뇌졸중 및 신경교종의 치료에 대한 최근 주목받고 있다. 광범위한 응용 분야와 비침습적 특성30,31을통해 FUS BBB 개방은 일상적인 입체 적 내 주사에 이상적인 대안입니다. 더욱이,인간30,32에서의현재 사용으로 인해, 이 기술을 이용한 전임상 조사는 매우 번역적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, FUS BBB 개방은 접근성의 부족으로 인해 기초 과학 및 전임상 연구에서 널리 확립 된 기술이 될 아직. 따라서 FUS BBB 개구부에 대한 벤치탑 접근 방식에 대한 자세한 프로토콜을 이 기술을 수립하는 데 관심이 있는 실험실의 출발점으로 제공합니다.

이러한 연구는 FUS 특이적 초음파 트랜스듀서 또는 저전력 댐프 형 초음파 침지 변환기중 고출력 공기로 수행되었다. 트랜스듀서는 반응형 부하및 표준 벤치탑 기능 발생기를 위해 설계된 RF 전원 증폭기로 구동되었습니다. 이러한 항목에 대한 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 실험 절차는 UAB 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 중점 초음파 운전 장비 설정

  1. 50개의 Ohm 동축 BNC 케이블을 사용하여 RF 증폭기의 출력에 초음파 트랜스듀서의 입력(1)을 연결하고 (2) RF 증폭기의 입력을 기능 발생기의 출력에 연결한다.
  2. 기능 발생기 모드를 1% 듀티 사이클로 초당 한 번 부비동성 버스트로 설정합니다.
    1. 50dB RF 앰프와 함께 사용되는 0.8인치 초점 거리를 가진 댐프드 1 MHz 저전력 침지 변환기의 경우 시작 설정을 설정합니다: 1 MHz 의 신파, 1V 피크에서 피크, 10k 사이클, 1s 간격(또는 기간).
    2. 공기 백업의 경우 1.1 MHz 고출력 트랜스듀서가 초기 설정을 1.1MHz 의 시네 파, 50mV 피크에서 피크까지, 11k 사이클, 1s 간격으로 설정합니다.
      참고: 수중이 아니면 트랜스듀서를 작동하지 마십시오. 손이나 다른 신체 부위를 초음파 초점에 놓거나 작동 하는 동안 트랜스 듀서 얼굴을 만지지 마십시오.

2. 집중 초음파 벤치탑 설정

  1. 입체 프레임과 스테레오테틱 프레임 홀더를 3D 인쇄합니다.
  2. PVC파이프(도 1a)를들고 있는 클램프를 사용하여 트랜스듀서를 XYZ 포지셔에 연결합니다. 클램프를 X축 슬라이드에 고정하고 날개 너트로 고정합니다.
    1. 고출력 초음파 트랜스듀서를 사용하는 경우 일치하는 자석 쌍을 사용하여 PVC 파이프에 부착하십시오. 한 자석에 구멍이 있고 다른 자석에 일치하는 돌출부가 있는지 확인합니다. PVC 파이프의 바닥을 캡하고 에폭시를 사용하여 자석 중 하나를 부착합니다(그림 1b참조).
    2. 에폭시를 사용하여 고전력 초음파 트랜스듀서의 상단 중심에 두 번째 자석을 부착합니다. 트랜스듀서의 중심에 있는지 확인하십시오(도1c).
  3. 고출력 초음파 트랜스듀서를 사용하는 경우 XYZ 포지셔터를 무효화하기 위한 포인터를 만듭니다. 이 포인터의 끝은 초음파 트랜스듀서가 XYZ 포지셔에 부착될 때 트랜스듀서 초점 의 중심 의 공간에서 위치를 나타냅니다. 트랜스듀서의 초점 거리의 길이와 트랜스듀서의두께(도 1d)로절단된 18G 바늘의 포인터를 만든다.
    1. 제3 자석에 에폭시를 적용하여 (이 자석은 PVC 캡 자석과 페어링) 포인터의 상단에 부착합니다. 그런 다음 포인터는 XYZ nulling(그림1d)에대한 PVC 파이프의 자석에 부착할 수 있습니다.
  4. 저전력 침수 변환기를 사용하는 경우 포인터와 장착 클립의 파일을 3D 인쇄합니다.
    1. 장착 클립을 PVC 파이프에 클리핑하여 저전력 침지 변환기를 PVC 파이프에 연결하고 트랜스듀서를 링에삽입합니다(도 1f).
  5. 동물의 머리 위에 쉴 수 있는 아크릴 시트에서 잘라낸 조각을 함께 붙이면 수조를 만드십시오(그림1e).
    1. 동물의 머리 크기에 관한 욕조 바닥에 개구부를 잘라냅니다. 폴리이미드 테이프로 수조의 구멍을 덮습니다.
      참고: 쥐의 털을 적시고 저체온증을 일으킬 수 있으므로 폴리이미드 테이프 주위에 물이 누출되지 않도록 주의해야 합니다.
  6. MRI 가시유체(예: 비타민 E 오일)로 직경 4mm 직경의 얇은 껍질 플라스틱 또는 유리 구를 채우고 밀봉하여 MRI 우세물을 만듭니다. 3D 프린팅 스테레오탁스프레임(그림 2a)의오른쪽에 MRI 신탁 홀더에 놓습니다.
  7. 3D 프릭스 프레임 홀더를 XYZ 포지셔너에 단단히 고정하여 동물 포지셔닝을 위한 좋은 위치에 있습니다. 프레임 홀더의 로스트랄 끝에 있는 탭을 Y축 레일의 일치하는 채널로 밀어 넣고 세트나사(그림 1h,빨간색 화살표)로 고정합니다.
  8. XYZ 포지셔너를 구동하려면 제조업체의 지시에 따라 컴퓨터에 USB를 설치하여 변환기를 연결합니다. 런타임 환경 과 모터 컨트롤러 소프트웨어를 PC에 설치합니다.
    1. 컨트롤러 소프트웨어의 전면 패널의 포트 선택 드롭다운 컨트롤에서 USB를 직렬 변환기로 선택하여 소프트웨어에서 적절한 직렬 포트를 선택해야 합니다. 9핀 직렬 크로스오버 케이블(예: RS232 널 모뎀 케이블)을 사용하여 USB를 스테퍼 모터 컨트롤러 상자에 연결합니다.
    2. 컨트롤러 소프트웨어를 실행하여 스테퍼 모터를 소프트웨어 제어하에 구동할 수 있는 테스트합니다. 이 단계에서는 로컬 IT 지원의 도움이 필요할 수 있습니다.

3. 두개 내 타겟팅 절차

참고: 250-350 g의 남성 스프라그 Dawley 쥐가 이러한 실험에 사용되었습니다. 동물은 물과 쥐 차우에 무료로 접근할 수 있었고, 12:12h 의 빛:어두운 주기로 유지되었다.

  1. 마취 하에 동물을 넣고 (산소가있는 3 % 이소플루란)과 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하십시오. 그런 다음 아래에 설명된 대로 카테터를 삽입합니다.
    1. 정맥에 쉽게 닿을 수 있도록 램프로 꼬리를 따뜻하게 합니다. 동물을 과열하거나 꼬리를 태우지 않도록 주의하십시오.
    2. 동물이 잠들면 (발가락 핀치에 반응하지 않음), 마이크로 버블, 에반스 블루 염료 (EBD), MRI를 사용하는 경우 가도부트롤 MRI 대비를 제공하는 데 사용되는 24 G 꼬리 정맥 카테터를 삽입합니다. 정맥이 부딪히면 혈액이 칼집을 채우고 안쪽 바늘을 천천히 제거하고 칼집을 정맥으로 더 밀어 넣습니다.
      참고 : 처음으로 쥐 꼬리 정맥 주사를하는 경우 스튜어트와 슈뢰더(33)와 같은 가이드를 참조하십시오.
    3. 혈류량이 없는 경우, 카테터 칼집을 정맥 밖으로 천천히 움직이면 바늘이 정맥을 뚫었을 수 있다는 것을 테스트합니다. 카테터가 약간 뒤로 당겨질 때 혈액이 흐르는 경우, 먼저 찌르고 카테터 배치는 이전 위치로 장밋빛 꼬리의 다른 위치에서 다시 시작해야합니다.
  2. 카테터 플러그를 식염수로 채우고 카테터 플러그를 카테터 포트 끝에 나사로 꽂아 포트가 피로 가득 차자마자 카테터 포트의 끝에 넣습니다. 실험실 테이프를 카테터와 꼬리 주위에 조심스럽게 감싸서 제자리에 유지합니다. 상단에 작은 조각으로 시작하고 카테터 플러그의 맨 끝을 노출 떠나, caudal 방향으로 작동합니다.
  3. 마취 라인을 스테레오탁스프레임(도 2a)의마취 커넥터에 연결하고 입에 입을 물린 막대에 놓고 이어바를 두 외이도로 안내하여 동물의 머리를 프레임안으로 고정한 다음 세트 나사를 조입니다. 동물의 머리가 안전하고 수준인지 확인하십시오.
  4. 동물을 MRI 침대로 옮기고 마취 선을 코 콘에 연결합니다. 이 프로토콜에서 9.4 T 작은 보어 동물 MRI가 사용되었다.
  5. 좌표 측정을 위해 전체 뇌뿐만 아니라 MRI신탁(도 2b)을캡처하는 관상 및 축 T2 가중 이미지를 수집합니다. MRI 프로토콜을 빌드할 수 있도록 로컬 MRI 물리학자 또는 기술에게 다음 정보를 제공합니다.
    1. 관상 이미지(그림 2b 상단)의 경우 이미지 수 : 27, 너비 : 62.2 mm, 높이 : 62.2 mm, 깊이 : 37.97 mm, 복셀 크기 : 0.24 x 0.24 x 1.41 mm3.
    2. 축 이미지(그림 2b 아래)의 경우 이미지 수 : 13, 너비 : 61.47 mm, 높이 : 53.81 mm, 깊이 : 16.7 mm, 복셀 크기 : 0.41 x 0.21 x 1.29 mm3.
      참고: 평면 해상도의 관상 동맥이 0.25mm에 가깝고 이미지가 전체 뇌와 fiducial을 커버하는 한 이러한 정확한 매개 변수를 가질 필요는 없습니다.
  6. FUS를 대상으로 하는 MRI fiducial에서 뇌 영역까지의 거리를 기록하여 위의 이미지에서 좌표 측정을 수집합니다.
    1. 스캐너에서 3.5 단계에서 수집된 관상 이미지에서 수탁이 가장 큰 이미지를 찾아 서체의 중심을 나타냅니다. 내측/측면 방향과 등쪽 복부 방향 모두에서(MRI 소프트웨어는 스케일 또는 포인트 측정 도구를 가지고, 로컬 MRI 기술 또는 물리학자와 상의)에 대한 뇌 영역의 상부에서 의외의 거리를 기록합니다(그림2b,상단).
    2. 스캐너에서, 3.5 단계에서 수집된 축 상에서, 신탁의 중심에서 표적 뇌 영역까지의 거리를 측정하고 내측/측면방향(도 2b,아래쪽)에서 형상의 맨 위를 측정하는 이미지를 찾아낸다.
    3. 두 개의 내측/측면 측정을 비교하고 서로 다른 경우 평균을 사용합니다. 이러한 좌표 측정은 XYZ 포지셔너를 사용하여 대상 뇌 영역으로 FUS 초점을 안내하기 위해 4.3 단계에서 나중에 사용됩니다.
  7. MRI 프레스스캔 이미지를 수집합니다. FUS BBB 개구부(그림4)를촬영한 이미지와 이러한 이미지를 비교합니다. T1 가중 이미지는 나중에 BBB 개방을 시각화하는 데 사용되며, T2 가중 이미지는 나중에 FUS 치료34이후 조직 손상이 발생하지 않도록 하기 위해 사용될 것이다.
    1. T1 가중 축 이미지의 경우 너비: 30mm, 높이: 51.2mm, 깊이: 3.0mm, 복셀 크기: 0.23 x 0.2 x 0.23 mm3,이미지 수: 13.
    2. T2 가중 축 이미지의 경우 너비: 30mm, 높이: 51.2mm, 깊이: 2.6mm, 복셀 크기: 0.2 x 0.2 x 0.2 mm3,이미지 수: 13.
    3. T1 가중 관상 이미지의 경우 너비 : 30mm, 높이 : 30mm, 깊이 : 27mm, 복셀 크기 : 0.16 x 0.16 x 1mm3,이미지 수 : 27.
    4. T2 가중 관상 이미지의 경우 너비 : 30mm, 높이 : 30mm, 깊이 : 27mm, 복셀 크기 : 0.12 x 0.12 x 1mm3,이미지 수 : 27.
      참고: 3.5 단계에서와 마찬가지로 이러한 이미징 매개 변수는 나열된 것과 정확히 동일할 필요는 없습니다. 이러한 이미지는 3.5 단계에서 수집된 것보다 더 작은 FOV 및 더 높은 해상도를 가지고 있습니다.
  8. 동물을 스테레오탁 프레임에 보관하고 MRI 침대에서 벤치탑 FUS 설정으로 신속하게 동물을 운반합니다. 동물은 마취의 효과에 따라 전송을 위해 잠을 유지있는지 확인합니다.
  9. 전송 시간이 길어지면 동물과 프레임에 맞게 충분히 큰 전송을 위해 상자를 사용합니다. 마취 플러그가 여전히 부착되어 있는 가운데, 동물과 프레임을 상자 안에 놓고 여분의 이소플루란이 몇 분 동안 상자를 채울 수 있도록 합니다. 마취 라인을 분리하고 신속하게 전송합니다.

4. 집중 초음파 절차

  1. FUS 벤치탑 설정에 도착하면 즉시 마취 라인을 코 콘에 연결하고 산소로 1.5-3 %의 이소플루란을 계속 실행합니다. 동물이 깨어나지 않도록 가능한 한 빨리 이 작업을 수행하십시오.
  2. 프레임을 프레임 홀더에 밀어 넣고 제자리에 단단히 놓습니다. 클리퍼를 사용하여 동물의 머리를 면도합니다. 여분의 모발을 닦고 모발 리무버 크림을 두피에 바치십시오. 3 분 동안 앉아서 물과 거즈로 닦아.
  3. MRI를 대상으로 사용할 수 없는 경우 표준(3D 인쇄되지 않음) 스테레오테틱 프레임을 사용하여 포인터 팁을 bregma에 터치하고 소프트웨어 또는 좌표를 기록하여 포인터 위치를 bregma에 null합니다. 소프트웨어의 최대 50 버튼을 클릭하고 변환기포인터를 교체하여 XYZ 캐리지를 50mm 위로 이동합니다. 이전에 설명 된 쥐 뇌 아틀라스에 따라35,소프트웨어의 스테핑 버튼을 사용하여 원하는 뇌 좌표로 이동. MRI 대신 이 메서드를 사용하는 경우 섹션 4.6로 건너뜁니다.
  4. MRI 안내를 사용하는 경우 포인터를 연결하고 포인터를 MRI 신탁의 위치로 이동합니다(도1d,g). 포인터를 MRI 신탁의 맨 위와 중앙에 배치합니다(주체 홀더 상단에 작은 구멍이 포인팅을 위해 제공됩니다). MRI 이미지의 모든 거리가 계산된 지점인 null 위치 단추를 클릭합니다.
  5. 포인터를 제거하고 위치 이동을 내측/측면 좌표 및 로스트랄/caudal 좌표로 이동합니다. 수조와 초음파 젤의 배치를 허용하기 위해 최대 50 버튼을 눌러 포지셔너를 올립니다. Z축 이동의 상단에 도달하면 nulling 위치가 무효화됩니다. 등/복부 좌표는 트랜스듀서가 추가된 후에 설정됩니다.
  6. 동물의 두피에 초음파 젤을 바르고 폴리이미드 테이프 창을 젤에 눌러 동물 위에 수조를 놓습니다. 초음파 젤에 기포가 없는지 확인하십시오.
  7. 수조를 탈가스로 채웁니다.
  8. 고출력 트랜스듀서를 사용하는 경우, 자석이 물 바로 위에 있도록 포지셔너를 낮춥다. 트랜스듀서를 비스듬히 물에 적어 기포가 얼굴 아래에 갇히지 않도록 하고 자석을 연결합니다.
  9. 저전력 침수 변환기를 사용하는 경우, 트랜스듀서 클립 바로 위에 있는 물속으로 포지셔를 낮춥시다. 그런 다음 투명기가 얼굴 아래에 갇히는 것을 방지하기 위해 비스듬히 물 속으로 낮춤으로써 트랜스듀서를 제자리에 잘라냅니다.
    참고: 투명 한 목욕 거품에 대 한 트랜스듀서 얼굴 아래 를 볼 때 도움이 됩니다.
  10. 포지셔너를 등쪽/복부 좌표로 낮춥춥시다.
  11. RF 전원 앰프를 켭니다.
  12. 3% 에반스 블루 염료(EBD)의 1mL/kg을 주입하여 바늘 끝을 카테터 플러그에 집어 넣고 주입합니다. 5 분 동안 순환할 수 있습니다.
  13. 거품 셰이커로 심하게 흔들어 마이크로 버블을 활성화합니다.
    1. 18G 날개 주입 세트에서 2개의 FUS 처리 및 튜빙을 고려하여 식염수의 0.2 mL에서30μL/kg의 용량을 30 μL/kg의 용량을 0.2 mL의 식염수로 준비합니다. 예를 들어, 쥐의 무게가 200g인 경우, 18G 바늘 끝을 포함하는 주사기를 식염수 1mL에 마이크로 버블 30 μL로 채웁니다.
      참고: 날개 달린 주입 세트로 복용하고 주입하는 데 18 G 바늘 팁을 사용해야 합니다.
    2. 주사기를 여러 번 반전하여 마이크로 버블의 균일한 분포를 얻습니다. 그런 다음 날개 달린 주입 세트를 부착하고 채웁니다. 주사기를 주입 펌프에 배치하고 주입 펌프를 설정하여 0.2 mL의 속도로 6mL/h를 제공합니다. 이것은 2 분 FUS 노출을 통해 마이크로 버블의 느린 주입을 제공할 것입니다.
    3. 날개 달린 바늘을 카테터 플러그에 삽입합니다.
  14. 먼저, 주입 펌프를 실행하고 3s를 기다린 후 기능 발생기의 출력 활성화 버튼을 눌러 FUS 처리를 시작합니다(재료 의 표에서기능 발생기에 "라벨"). 마이크로 버블이 지울 수 있도록 5 분 사이에 이 두 번 영역당 이 두 번 반복하십시오.
    1. 주입 펌프가 2 분 에서 중지 할 때 FUS 치료를 중지 기능 생성기에서 다시 켜진 버튼을 누릅니다.
    2. 마이크로 버블이 지울 때까지 5 분 기다립니다. 그런 다음 주입 및 두 번째 FUS 치료를 시작합니다.
    3. 두 번째 FUS 치료 직후, 가도부트롤 대비(MRI를 사용하는 경우) 및 관심 있는 제제, 예를 들어 바이러스 성 입자를 주입한다. 모든 에이전트의 총 전달 량은 5mL/kg을 초과해서는 안됩니다.
      참고: 관심 있는 에이전트의 납품 타이밍(예: FUS BBB 개장 전후)은 사용되는 에이전트에 따라 다를 수 있습니다.
  15. RF 전원 앰프를 끄고 즉시 동물을 MRI로 다시 운반합니다.

5. BBB 오픈MRI 확인

  1. MRI를 사용할 수 없는 경우 섹션 6으로 건너 뛰고 EBD 식을 사용하여 BBB 개구부를 확인합니다.
  2. 동물을 MRI 침대에 다시 3.7 단계와 동일한 위치에 놓고 마취 라인을 연결합니다.
  3. BBB 개구부 영역에서 가도부트롤 MRI 향상을 시각화하기 위해 3.7 단계에서 사용되는 동일한 이미징 매개변수로 MRI 포스트 스캔을 수집한다(도3b,e).

6. 관류 및 조직 수집

  1. 혈액이 완전히 명확 해질 때까지 차가운 4 % 포르말린으로 동물을 perfuse.
  2. 뇌를 제거하고 하룻밤 사이에 4 % 포르말린 또는 PFA에 배치하십시오. 다음으로, 뇌가 가라 앉을 때까지 30 % 자당 용액 (약 2-3 일)에 뇌를 배치합니다. 마지막으로 액체 질소 나 드라이 아이스에 플래시 동결 및 냉동 절제 될 때까지 -80 ° C에 저장합니다.
  3. 10 월에 뇌를 동결 하 고 냉동 섹션을.
  4. 형광 현미경 검사법을 위한 고정 및 커버슬립 섹션. EBD 여기는 470 과 540 nm에서 피크와 680 nm에서 배출 피크. 전반적인 세포 형태를 시각화하기 위해 DAPI 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

여기서, 우리는 마이크로버블을 이용한 집중초음파가 저전력 침수 트랜스듀서(도3)와FUS 트랜스듀서(도4)를모두 사용하여 위에 지정된 파라미터를 사용하여 국소화된 BBB 개방을 유도할 수 있음을 입증한다. 첫째, 초기 실험에서 저전력 침수 트랜스듀서는전방(도 3b)또는 내측(도3a)의뇌 반구 를 표적으로 삼았다. 동물은 2시간 후에 관류(도3a)또는 관류(도3b)및 10μm 냉동 뇌 섹션으로 희생하였다. FUS BBB 개방은 대상 반구에서 EBD 자동 불발 (여기 : 470 및 540 nm, 방출 : 680 nm)에 의해 분명했다 (흰색 화살표 그림 3

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에서 우리는 마이크로 버블에 대한 벤치탑 접근 방식이 MRI 지침의 유무에 관계없이 두개 내 표적화에 대한 두개 내 표적화 방법, 두개 내 표적을 위한 두가지 변형 및 방법을 포함하여 대체 접근 방식으로 FUS BBB 개방을 지원했습니다. 현재 랩에 MRI 유도 FUS BBB 개구부를 설치하기 위해 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 매우 표준화되고 재현 가능한 결과를 제공하는 우수한 즉시 사용할 수 있는 장치를 구매할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나 많은 실험실은 이러한 기기의 비용에 대해 준비되지 않습니다. 따라서 이 프로토콜의 주요 목표는 기술 분야에서 전문 지식을 구축하기 위해 모든 실험실이 설정할 수 있는 출발점을 제공하는 것입니다.

FUS BBB 개방은 이제 널리 사용되는 기술이며, 종종 다른 그룹이 다양한 에이전트와 마취제를 활용하는 경우, 각각BBB 개방 및 사치의 정도에 영향을 미칠 수 있습니다. 중요한 것은, 사용된 특정 마취제는 BBB 개방의 크기에 영향을...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 클렘슨 대학에 NSF EPSCoR 연구 인프라 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (1632881). 또한, 이 연구는 시비탄 국제 연구 센터, 버밍엄, AL에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 감사 버밍엄 작은 동물 이미징 공유 시설 보조금 [NIH P30 CA013148]에서 앨라배마 대학의 서비스와 시설의 사용을 인정합니다. 저자들은 라지브 초프라의 지지와 지도에 대해 인정한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
버블 셰이커Lantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, Definity 마이크로 버블을 활성화하는 데 사용되는 활성화 장치
카테터 플러그/ 주입 캡SAI 주입 기술부품 번호: IC카테터 플러그/ 주입 캡
Evans 블루 염료SigmaE2129-10GEvans 블루 염료
기능 발생기TektronixAFG3022B듀얼 채널, 250MS/s, 25MHz
FUS 변환기, 1.1MHzFUS 기기TX-1101MHz MRI 호환 구형 초점 초음파 변환기(수중청음기 포함
) 생쥐 및 쥐용 가열 패드Kent ScientificPS-03가열 패드 - 생쥐 및 쥐용 PhysioSuite
주입 펌프KD Scientific780100KDS 100 레거시 단일 주사기 주입 펌프
Kapton 테이프기즈모 Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		Gizmo Dorks Kapton 테이프(폴리이미드) 3D 프린터 및 인쇄용, 8 x 8인치, 팩당 10장
저전력 침수 변환기, 1MHzOlympusV303-SU침수 변환기, 1MHz, 0.50인치. 요소 직경, 표준 케이스 스타일, 스트레이트 UHF 커넥터, F=0.80IN PTF
마그넷 세트WINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15mm 재봉용 마그네틱 백 걸쇠 재봉 스크랩북 - 10 세트
RF 증폭기E& IA07575W
꼬리 정맥 카테터BD382512/ 피셔 항목: NC122851324g BD Insyte Autoguard 차폐 IV 카테터(비날개형)
초음파 대비 마이크로버블Lantheus Medical ImagingDE4, DE16DEFINITY(Perflutren 지질 마이크로스피어)
초음파 젤Aquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		초음파 젤 Aquasonic 100 변속기 1리터 스퀴즈 병
날개 달린 주입 세트, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion Sets
모터 컨트롤러 소프트웨어N/AN/AVelmex 모터 컨트롤러 런타임 환경을 제어하기 위해 LabView로 작성된 맞춤형 소프트웨어
National InstrumentsLabView 런타임 엔진 버전 2017 이상https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3축 선형 스테이지 액추에이터(XYZ 포지셔너)Velmex
볼트VelmexMB-1BiSlide 볼트 1/4-20x3/4" 소켓 캡 나사(10팩), 수량:3
모터 컨트롤러VelmexVXM-3제어, 3축 프로그래밍 가능 스테핑 모터 제어, 수량:1
마운팅 클리트VelmexMC-2클리트, 2홀 BiSlide, 수량: 6
마운팅 클리트VelmexMC-2클리트, 2홀 BiSlide, 수량: 2
개의 USB-직렬 변환기VelmexVXM-USB-RS232USB-RS232 직렬 통신 케이블 10ft, 수량: 1
x축 선형 스테이지VelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, 이동=10인치, 2mm/rev, 제한, NEMA 23, 수량: 1
x축 스테퍼 모터VelmexPK266-03A-P1Vexta 유형 23T2, 단일 샤프트 스테퍼 모터, 수량 : 1
y 축 선형 스테이지VelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, 이동 = 10 인치, 2mm / rev, 제한, NEMA 23, 수량 : 1
y 축 스테퍼 모터VelmexPK266-03A-P1Vexta 유형 23T2, 단일 샤프트 스테퍼 모터, 수량 : 1
z 축 댐퍼VelmexD6CL-6.3FD6CL 댐퍼 유형 23 더블 샤프트 스테퍼 모터, 수량 : 1
z 축 선형 스테이지VelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, 이동 = 10 인치, 2mm / rev, 한계, NEMA 23, 수량 : 1
z 축 스테퍼 모터VelmexPK266-03B-P2Vexta 유형 23T2, 이중 샤프트 스테퍼 모터, 수량 : 1
3D 인쇄 가능한 파일
침수 변환기 마운트 및 포인터https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
입체 프레임https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
입체 프레임 홀더
https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX 9.4T 소구경 동물 MRIBruker BrukerBioSpec 94/20ParaVision 버전 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
크림 헤어 리무버교회 & 드와이트나이르 크림
가도부트롤 MRI 조영제바이엘가다비스트(Gadobutrol, 1mM/mL)
정위 프레임Stoelting#51500MRI 호환
불가 턴키 FUS 전달 장치FUS InstrumentsRK-300설치류용 MRI 호환 FUS 사용 준비
모터 컨트롤러 소프트웨어용 개의 개의 개의 완료

참고문헌

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

MRI
쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.