여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
여기서 설명된 공초점 반사 현미경 보조 단세포 인천성광 분석(CRIF),3차원(3D) 공간에 분포된 인구에서 각 개별 라이브 셀로부터 선천적인 세포 형광 시그니처를 재구성하는 최소 침습적 방법이다. 세포의 타고난 형광 시그니처는 세포 내의 다양한 생체 분자에 의해 방출되는 형광 신호의 모음입니다. 이전 연구는 타고난 형광 서명이 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영하고 세포 특성화 및 식별을위한 풍부한 정보 소스임을 확립했습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 인구 수준에서 분석되어 복제 배양을 필요로하지만 단일 세포 수준에서는 그렇지 않습니다. CRIF는 개별 세포에서 형광 신호의 3D 해상도 및/또는 선택적 추출을 요구하는 연구 결과에 특히 적합합니다. 형광 서명은 세포의 타고난 특성이기 때문에 CRIF는 그대로 및 단일 세포의 유형 및 / 또는 생리 적 상태의 태그없는 예측에도 적합합니다. 이 방법은 이종 집단에서 각 단일 세포의 표현형이 세포 태그없이 현미경의 밑에 그것의 자동 형광 서명에 의해 직접 평가될 수 있는 능률적인 세포 분석을 위한 강력한 공구일 지도 모릅니다.
서론
셀1 내의 다양한 생체 분자는 자가 형광 신호를 방출하고, 세포의 타고난 형광 서명은 이러한 신호의 조립으로 구성된다. 이 시그니처 형광은 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영합니다. 선천적 형광의 분석은 최소 침습적이며 온화한 신진 대사 수정에서 완전한 세포 파괴에 이르기까지 다양한 흔적을 남기는 전통적인 침습적 미생물 프로브를 보완 할 수 있습니다. DNA 또는 세포 함량 추출2,3, 시투 혼성화4의 형광등, 그리고 게놈에 형광 기자 유전자의 도입과 같은 전통적인 기술은 세포 유형 또는 생리적 상태를 결정하는 데 효과적이지만, 일반적으로 세포의 조작또는 침습적 태깅이 필요합니다.
벌크 미생물 배양 현탁액5,6, 활성 슬러지7, 포유류 조직8,9 및 <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 샘플 준비
- 유리 슬라이드에 우물이 있는 1mm 두께의 실리콘 개스킷을 놓습니다.
- 실리콘 개스킷의 우물에 1mm 두께0.8%(w/v) 아가로즈 슬래브를 놓습니다.
- 임의미생물세포배양주의 세포밀도를 600nm(OD660) = 1.0에서 광학 밀도로 희석한다.
- 아가로즈 슬래브에 세포 현탁액의 5 μL 알리쿼트를 놓습니다.
- 유리 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.
2. 현미경의 설정
참고: CRIF 기술은 공초점 반사 현미경 검사법(CRM)과 멀티채널 공초점 현미경 분석법을 결합합니다. CRM은 세포 선천성 형광과는 무관한 세포 형태학 및 공간 국소화를 위한 정보의 근원 역할을 합니다. 멀티채널 공초점 현미경 검사는 세포 선천성 형광의 스펙트럼 정보를 제공합니다. 다음 프로토콜에서, CRM 또는 공초점 형광 현미경 분석기로 취득된 모든 심상은 CRM 영상 또는 다중 채널 공초점 현미경 분광법 심상으로, 각각 지칭된다.
- 소멸된 스펙트럼 채널과 공초점 현미경을 광증 튜브(PMT) 또는 GaAsP 검출기에 연결합니다.
참고: 이러한 설정은 여러 제조업체에서 사용할 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
도 1A는 전통적인 스펙트럼 플롯(top)과 히트맵(middle)으로 제시된 세균 세포의 전형적인 단세포 형광 서명을 나타낸다. 도 1B는 토양 박테리아집단의 원래 CRM 이미지 위에 중첩된 정확한 2D 세포 세분화의 결과를 나타낸다(슈도모나스 푸티다 KT2440)12. 인구에 대한 그 결과 타고난 형광 서명은 도 1D의 히트맵으로 제시됩니다. 성공적인 세포 세분화 에 따라 인구 내 변동성은 상대적으로 미미했다. 부정확한 세포 세분화의 예는 도 1B에 도시된 것과 동일한 P. putida에 겹쳐지는 도 1C에 도시된다. 인구의 타고난 형광 서명에 부정확한 세포 세분화의 영향은 상당한 수의 이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
재현 가능한 결과를 얻기 위해 밀접하게 따라야 하는 두 가지 중요한 점이 있습니다: 1) 심내 목표하에서 레이저 전력 출력을 관찰하고, 2) 정확한 세포 세분화를 수행한다.
첫 번째 점은 다른 실험 중 타고난 형광 서명을 비교할 때 특히 중요합니다. 최대 전력 출력이 레이저 라인 간의 크기 순서까지 다를 수 있기 때문에 단순히 동일한 "백분율 출력" 설정을 여기 파장(예: 405, 488, 514 및 530 nm 레이저 라인 모두에 대해 5%의 전력 출력을 사용하는)에 적용하지 마십시오. 또한, 목표와 내부 광학은 일반적으로 고르지 않은 광학 흡수 특성을 가지며, 이는 또한 고려해야 한다. 이러한 이유로 레이저 파워 미터(재료 표)를 사용하여 목표하에서 출력을 측정하는 것이 좋습니다. 레이저 라인의 출력이 몇 년 동안 크게 붕괴 될 수 있기 때문에 이 측정을 몇 가지 실험마다 또는 주기적으로 하는 것이 좋습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 일본 교육문화체육관광부(18K04843)에서 YST ERATO(JPMJER1502)에서 N. 노무라까지 과학연구보조금으로 부분적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| 빔 스플리터 | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 또는 MBS 488/543/633 빔 스플리터(Carl Zeiss) | |
| 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss, Nikon | 모델 LSM 880(Carl Zeiss), 모델 A1R(Nikon) | |
| 커버 슬립 | Matsunami Glass | C024601 | |
| 유리 슬라이드 | Matsunami Glass | S011120 | |
| 반 반사 거울 | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| 레이저 파워 미터 | Thorlabs | PM400 (파워 미터 콘솔) 및 S175C (센서) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | 박테리아 배양 |
| 이미지 분석 소프트웨어 | The MathWorks | MATLAB 버전 2019a 이상, Image Processing Toolbox 필요 | |
| 현미경 대물렌즈 | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | (예 : 63x 계획 Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| 현미경 소프트웨어 | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| 프로그래밍 언어 | 제공된 PCA 스크립트를 실행하려면 Python 및 라이브러리, 모듈(numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter)이 필요합니다. | ||
| 실리콘 개스킷 | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| 워크스테이션 | 개별 GPU가 있는 고성능 워크스테이션을 사용하는 것이 좋습니다. | ||
| 효모 추출물-펩톤-포도당(YPD) 한천 배지 | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | 효모 배양용 |
| YPD 배지 | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
참고문헌
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
