방법 논문

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석체를 이용한 생물학적 시료의 산화 스트레스 평가

DOI:

10.3791/61122

⸱

2020년 5월 12일

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

이 논문에서

요약

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티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.

초록

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제한된 분석 특이성과 견고함에도 불구하고 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석법은 생물학적 유체의 지질 과산화의 일반적인 지표로 널리 사용되고 있습니다. 시료가 적절히 처리되고 저장되었다는 경우 생물학적 시료 내에서 산화 스트레스 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 분석은 지질 과산화 제품의 반응을 포함, 주로 말론 다이얼데히드 (MDA), 티오 바르비투산 (TBA),TBAR라는 MDA-TBA2 어덕트의 형성에 이르게. TBARS는 532 nm에서 분광측정으로 측정할 수 있는 빨간색 분홍색 색상을 생성합니다. TBARS 분석법은 산성 조건(pH = 4) 및 95°C에서 수행됩니다. 순수 MDA는 불안정하지만 이러한 조건은 MDA 비스 (디메틸 아세탈)에서 MDA의 방출을 허용하며, 이는이 방법의 분석 표준으로 사용됩니다. TBARS 분석법은 약 2시간 안에 완료할 수 있는 간단한 방법입니다. 분석 시약의 준비는 여기에서 자세히 설명되어 있습니다. 예산에 민감한 연구원은 단일 표준 곡선의 시공을 허용하는 고가의 TBARS 분석 키트를 구입하는 대신 저렴한 비용으로 여러 실험에 이러한 시약을 사용할 수 있습니다 (따라서 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다). 이 TBARS 분석법의 적용성은 인간 혈청, 저밀도 지단백 및 세포 용해에서 나타난다. 분석은 일관되고 재현 가능하며 1.1 μM의 검출 한계에 도달 할 수 있습니다. 분광성 TBARS 분석기의 사용 및 해석에 대한 권장 사항이 제공됩니다.

서론

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지질 과산화는 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종과 같은 자유 라디칼이 지질의 탄소 탄소 이중 결합을 공격하는 과정으로, 탄소로부터의 수소의 추상화와 산소 분자의 삽입을 수반하는 과정입니다. 이 과정은 주요 제품으로 지질 페록실 라디칼, 하이드로퍼산화물, 말론다이얼데히드(MDA) 및 4-하이드록시논날을 주요 이차 제품으로 포함하는 복잡한 제품의 혼합물로 이어집니다1.

MDA는 티오바르비투릭 산 (TBA)과의 촉진 반응으로 인해 지질 과산화의 마커로 생물 의학 연구에서 널리 사용되었습니다. 반응은 MDA-TBA2의 형성으로 이끌어 냅니다, 532 nm에서 가시 스펙트럼에서 흡수하고 빨간 분홍색 색깔2를 생성하는 합자. MDA 외에 지질 과산화에서 파생 된 다른 분자는 또한 TBA와 반응하고 532 nm에서 빛을 흡수 할 수 있으며, 측정되는 전반적인 흡수 신호에 기여합니다. 유사하게, MDA는 생체 분자의 대부분의 그밖 주요 종류와 반응할 수 있습니다, 잠재적으로 TBA3,4를 가진 반응에 대한 그것의 접근성을 제한합니다. 이와 같이, ....

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프로토콜

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인간 혈청 표본은 IRB 승인에 따라 자원 봉사자의 동의와 헬싱키 선언에 표현 된 원칙에 따라 얻은. 표본은 분석 실험실로 이송되기 전에 코딩및 식별을 해제했습니다.

1. 샘플 준비

  1. HepG2 셀 용해
    1. 16T75 플라스크에서 플라스크 당 약 10 x 106 HepG2 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하고 2일 동안 세포를 성장시켰다.
    2. RIPA 버퍼 준비: 50 mL 튜브에서 5 M NaCl의 1.5 mL, 1 M Tris-HCl (pH = 7)의 2.5 mL, NP-40 시약의 500 μL을 추가 한 다음 DI 물로 최종 부피를 50 mL로 가져 올립니다.
    3. 리시스 버퍼 준비: ALIquot 20 mL의 RIPA 버퍼를 50 mL 튜브에 넣고 단백질과 지질 분해를 억제하기 위해 100x 프로테아제 억제제 용액의 200 μL을 추가합니다. 4 °C에 보관하십시오.
      참고: 리시스 버퍼는 TBARS 시약과 호환되며 532 nm에서 흡광도를 방해하지 않습니다. 다른 리시스 버퍼를 사용하거나 리시스 버퍼에 추가 성분을 추가하려는 경우 리시스 버퍼 구성 요소가 TBARS 분석과 호환되는지 확인하기 위해 예비 유효성....

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결과

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산성 조건(pH = 4)과 95°C에서 말론다이얼데히드(MDA) 비스(디메틸 아세트탈)는 MDA23을 산출한다. MDA와 밀접한 관련이 있는 화학 콘게너들은 티오바르비투르산(TBA)의 두 분자와 반응하여 티오바르비투릭 산 반응성 물질(TBARS)이라고 불리는 화합물을 생산하여 붉은 분홍색 색상을 주고 532nm에서 흡수성 λmax 를 갖는다(도 1, 도 2). MDA 비스(dimethyl acetal)를 표준으로 사용하여 표준 곡선(도 3, 표 1)이 생성되어 3개의 상이한 생물학적 샘플에서 분석 및 산화 의 검출 및 검출 도성의 한계를 결정하였다. 총 9개의 TBARS 소약이 다른 날에 3개의 다른 견본에 있는 산화의 수준을 결정하기 위하여 수행되었습니다. 따라서

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토론

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그 한계에도 불구하고1,3,4,8,9,10,12,12,13,14,15,19 및 실험실 사이의 비교에 대한 적합성의 부족에도 불구하고, TBARS 분석은 가장 오래된 중 하나입니다

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공개 사항

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저자는 경쟁 적인 재정적 이익 이나 공개 하는 이해의 다른 충돌.

감사의 글

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여기에서 보고된 연구는 상 아니의 밑에 건강의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었습니다. R33 CA217702 및 학생 개발 극대화 이니셔티브(IMSD) 프로그램. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x 멸균 PBS pH 7.4 1 LVWR, PA--262세포 용해 시약
50 mL 독립형 원심분리기 튜브Corning, NYCLS430897일반 재료
96웰 플레이트, 비처리, 투명, 뚜껑 포함, 비멸균Thermo Fisher Scientific, MA280895흡광도 측정
Amicon Ultra-0.5 100 kD 원심 스핀 필터 장치Fisher Scientific, NHUFC510024 LDL정제
캡Thermo Fisher Scientific, MA14-930-15DTBARS 분석
구리 II 염화물SIGMA, MO222011-250G산화 유도
배양 튜브, 일회용, 스크류 캡 마감 처리, 붕규산 유리(13 x 100mm)VWR, PA53283-800TBARS 분석용
Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2 세포 배지
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf, NY22363204일반 재료
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLGenesee Sceitific, CA22363352일반 재료
Fetal Bovine Serum US SourceOmega Scientific, CAFB-11세포 배양
빙하 아세트산SIGMA, MO27225-1L-RTBARS 시약
정지 프로테아제 억제제 칵테일(100x)Thermo Scientific, MA87786세포 용해 시약
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL 용매
HepG2 세포ATCC, VAHB-8065생물학적 매트릭스 프로토타입
Hydrocloric acid (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212세포 용해 시약
Legend Micro 17 CentrifugeThermo Scientific, MA75002431일반 재료
저밀도 지단백질, 인간 플라즈마아테네 연구 및 Technology, GA12-16-120412생물학적 매트릭스 프로토 타입
마그네틱 스티어 바, 팔각형 6 구색VWR, PA58948-025일반 재료
Malondialdehyde bis (디메틸 아세탈)SIGMA, MO8207560250TBARS 표준
Multiskan Go Microplate 분광 광도계Fisher Scientific, NH51119200흡광도
NP-40측정EMD Millipore Corp, MA492016-100ML세포 용해 시약
염화나트륨SIGMA, MOS7653-1KG세포 용해 시약
도데실황산나트륨(SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS 시약
수산화나트륨SIGMA, MO367176-2.5KGTBARS 시약
SpeedVac 농축기Thermo Scientific, MASC250EXP 농축 세포 용해물
T-75 플라스크, 조직 배양 처리, 250 mL, 필터 캡 포함USA Scientific, FL658175세포 배양
티오 바르 투르 산SIGMA, MOT5500-100GTBARS 시약
TRIS 염기Fluka, GA93362세포 용해 시약
Trypsin (1x)VWR, PA16777-166HepG2 세포 분리
101642 유리관용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.

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Thiobarbituric Acid Reactive SubstancesTBARS AssayLipid PeroxidationOxidative StressMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisBiological SamplesStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

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